布魯氏菌Omp2b優勢T-B聯合抗原表位的免疫應答特點研究

李大偉，朱玥潔，霍怡杉,李智偉，江曉明，沙 桐，陳志強，張峰波，丁劍冰

布魯氏菌是一種引起人獸共患傳染病的病原菌，即引起布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)[1-3]，目前已經在《中華人民共和國傳染病防治法》把它歸類為乙類傳染病，與我們熟悉的非典、豬流感、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同屬乙類傳染病[4]。用于動物的布病減毒疫苗有兩種，分別是：A19、S2，但是目前廣泛用于布病防控的疫苗也存在一定的缺陷，如不同程度的出現急性布魯氏菌病或副反應的癥狀[5]。盡管在布魯氏菌病防治中疫苗免疫起到了非常重要的作用，但目前全球范圍內沒有國際上認可的用于人的布病疫苗。Omp2b作為布魯氏菌外膜蛋白的一員，其具有很好的免疫原性，不但可以激發機體產生細胞免疫而且也可以產生體液免疫，而且可以通過遺傳工程技術來表達，通過研究發現布魯氏菌外膜蛋白Omp2b是一種良好的抗原成分。

本研究采用生物信息學分析方法分析了Omp2b蛋白的結構[6-7]，并預測了T細胞和B細胞的優勢表位得到了T-B聯合抗原表位：196-216區段，并人工合成肽段，利用合成肽段與布魯氏菌病患者和健康人群的血清進行免疫反應，通過分析其誘導的體液及細胞免疫應答的效果，研究結果可為進一步研究布魯氏菌疫苗奠定基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 研究對象 羊種布魯氏菌Omp2b(GenBank：AMM72579.1)蛋白氨基酸序列：GenBank中的長度為362 bp的羊種布魯氏菌Omp2b來源于NCBI網站。收集2017年9月至2019年5月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院感染性疾病中心明確診斷為布病且有詳細病歷資料的30名慢性布病患者(患者組)和35名健康人(對照組)參加本研究[9]，每1位患者均簽署知情同意書，且本研究所有實驗均經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理學委員會批準(倫審號：20150225-94)。

1.2 方 法

1.2.1 T和B表位預測和分析 我們使用SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitope prediction.htm)和IEDB(http://tools.immuneepitope.org/)來預測OMP2b蛋白的T細胞表位。我們使用HLA-A*1101預測相應的CTL表位，同時選擇HLA-DRB1*0701預測Th表位。使用 DNAStar軟件和IEDB來預測OMP2b蛋白的B細胞表位。最后通過比較分析確定Omp2b的T、B細胞表位和T-B聯合表位。

1.2.2 Omp2b免疫誘導的T細胞免疫應答 ELISPOT平板涂有特異性抗人IFN-γ抗體(人IFN-γ試劑盒，Cat#552138，BD，SanDiego，CA，USA)在PBS中以1∶60稀釋過夜，溫度為4～8 ℃。將板用PBS洗滌5次，并用含有10%胎牛血清(FCS)(Sigma)的100 μL RPMI1640培養基(Sigma Aldrich，St.Louis，UA)在37 ℃封閉1 h。將PBMC懸浮液(2×105)加入ELISPOT板中。PBMC懸浮液(2×105)和5 μg/mL TB結合的表位肽加入適當的孔中。每個樣品有3個重復的孔。僅PBMC加培養基作為陰性對照和PBMC加上植物血凝素(PHA)用作陽性對照。將板在37 ℃、5% CO2下孵育19 h。之后，孵育平板用IFN-γ特異性生物素化抗體和鏈霉抗生物素蛋白-HRP。最后，使用ELISPOT自動平板讀數器(AID Elispot Reader，AID，Germany)計數IFN-γ特異性斑點形成細胞(SFU)。

1.2.3 Omp2b免疫誘導的特異性抗體應答 將合成的T-B聯合表位(6 μg/mL)包被在碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的微孔板上，然后用5%脫脂乳封閉。加入血清樣品后，將板在37 ℃下孵育60 min。洗滌板后，以1∶1 000的比例加入HRP標記的小鼠抗人IgG(BD)作為二抗，并在室溫下孵育30 min。再次洗滌板后，加入底物溶液，通過酶標儀(PERLONG，DNM-9602，北京，中國)測量OD450和OD620每個孔的值。使用OD值評估 IgG的相對水平。

1.2.4 CTL表位誘導穿孔素和顆粒酶B的分泌 將PBMC懸浮液(2×105)在含有或不含有5 μg/mL肽的CTL表位的96孔板中與含有10%FCS的RPMI1640培養基一起培養。在37 ℃溫育3 d后，收集細胞培養物上清液。分別通過ELISA測量分泌的穿孔素(人穿孔素ELISA pro試劑盒，3465-1HP-2，Mabtech，Stockholm，Sweden)和顆粒酶B(人顆粒酶B ELISA開發試劑盒，3485-1H-6，Mabtech，Stockholm，Sweden)。將板用4 μg/mL抗人穿孔素(克隆Pf-80/164)或2 μg/mL粒酶B抗體(克隆GB10)在4 ℃～8 ℃下包被過夜。用PBS洗滌后，用含有0.05%吐溫20(Sigma)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的PBS封閉1 h。分別添加樣品和標準品。將板在室溫下溫育2 h。用PBS洗滌3次后，加入與抗生物素蛋白結合的抗孔蛋白抗體(1 μg/mL;克隆Pf-344)或抗顆粒酶B抗體(1 μg/mL;克隆GB11)并在室溫下孵育1 h。洗滌后，加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP并在室溫下溫育1 h。最后，加入TMB并孵育15 min以進行顯色。通過PERLONG DNM-9602在OD450和OD620下測量該板，基于標準曲線確定樣品濃度。

2 結 果

2.1 T-B聯合優勢抗原表位檢測 通過生物信息軟件對T細胞表位和B細胞表位的綜合分析最終篩選出T-B細胞聯合優勢抗原表位是：196-216(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)。

2.2 Omp2b免疫誘導的T細胞免疫應答 為了測試T-B聯合表位的免疫原性，將合成的T-B聯合表位與PBMC共同培養并進行ELISPOT測試。ELISPOT可以在細胞通過顯色反應分泌這種可溶性蛋白質的相應位置顯示清晰可辨的斑點，并且可以在顯微鏡下或通過ELISPOT分析系統直接計數斑點。表明Omp2b可誘導T細胞免疫應答。患者產生IFN-γ的T細胞高于健康對照組(F=25.413,P<0.01)(圖1和圖2)。

圖1 ELISPOT 檢測結果

*P<0.05，**P<0.01 SFU：spot forming units

2.3 Omp2b免疫誘導的特異性抗體應答 為了評估T-B聯合表位是否具有產生抗體的能力，進行ELISA(見圖3)。在布病患者中檢測到針對T-B聯合的Omp2b蛋白表位肽的特異性IgG，但在健康對照組中未檢測到。兩組抗體水平有差異統計學意義(F=13.555,P<0.01)。

*P<0.05，**P<0.01

2.4 CTL表位誘導穿孔素和顆粒酶B的分泌 為了進一步探究CTL表位是否可誘導T細胞免疫應答反應，通過ELISA方法檢測上清液中的穿孔素和顆粒酶B的濃度(pg/mL)，并與單獨加入PBMC的對照孔進行比較。加入CTL肽段的試驗孔比不加入肽段的對照孔的顆粒酶B和穿孔素的濃度升高(F=13.653，P<0.01)。這些結果表明，Omp2b蛋白預測的CTL表位在刺激T細胞產生免疫應答方面是有效的(圖4)。

*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

開發預防布魯氏菌病的有效疫苗尤為重要。有效的疫苗受許多因素的影響，包括蛋白質的結構和位置[10]。對一級結構的分析發現，Omp2b是穩定的蛋白質，有利于疫苗的構建。在蛋白質的二級結構中，β-轉角區域和無規卷曲區域有利于形成表位區域[11]。

有效的疫苗不僅應具有合理的蛋白質結構，還應具有有效的T和B細胞表位[12-13]。因此，使用不同的軟件分析了Omp2b的T和B細胞表位。T細胞表位必須能夠加工成與相應MHC結合的肽，然后被TCR識別[14]。T細胞表位分別由CTL和Th細胞識別的MHC I和MHC II分子呈遞。布魯氏菌是一種細胞內病原體，細胞免疫在去除致病菌方面起著重要作用[15]。使用SYFPEITHI和IEDB來分析Omp2b的T細胞表位[16-17]。選擇的HLA分子類型為HLA-A*1101和HLA-DRB1*0701，在新疆人群中頻率較高，可用于預測[18-19]。由B細胞產生的特異性抗體可以有效地識別病原體并引發隨后的一系列免疫應答。因此，B細胞表位在疫苗開發中起重要作用[20]。利用DNAStar和IEDB軟件進行預測。將IEDB的表位預測與親水性、表面可及性和靈活性的結果相結合，以排除α-螺旋和β-折疊區域中的B細胞表位。親水、柔性和表面可及的區域通常是形成B細胞表位的主要區域[21]。篩選后，通過生物信息學軟件最終篩選得出了1個Omp2b蛋白的T-B聯合優勢抗原表位：196～216區段(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)，T-B聯合優勢抗原表位可被Th和B細胞識別并激活細胞和體液免疫來消除病原體。

使用ELISA檢測患者組和對照組中的特異性抗體，并且在布病患者血清中檢測到了針對T-B聯合表位肽的特異性抗體。通過研究發現布魯氏菌的Omp2b可以在布魯氏菌感染后刺激相應特異性抗體的產生。同時，從患者組和對照組中分離出PBMC，并使用ELISPOT方法檢測T-B聯合表位肽誘導Th細胞產生免疫應答。結果顯示，Omp2b的表位可以誘導IFN-γ的產生，可以誘導Th細胞的免疫應答。

為驗證Omp2b的預測CTL表位的免疫反應性，將CTL表位肽與患者的PBMC共培養，并檢測上清液中的穿孔素和顆粒酶B水平。CTL細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶B發揮細胞毒作用。結果顯示，加入CTL表位肽后，培養上清液中的穿孔素和顆粒酶B的水平顯著增加。因此，CTL的優勢表位可以促進穿孔素和顆粒酶B的產生并誘導細胞免疫應答。

綜上，通過生物信息學最終篩選出了1個T-B細胞聯合優勢抗原表位196～216區段。T-B聯合優勢表位合成的肽段能刺激免疫細胞產生穿孔素、顆粒酶、細胞因子，并能與患者特異性IgG結合，具有良好的免疫反應性，表明T-B聯合優勢抗原表位能誘導機體產生特異性的細胞和體液免疫應答，為進一步研制布魯氏菌疫苗提供了實驗依據。

利益沖突：無