陜西省布魯氏菌菌株多位點序列分析研究

聶守民，羅波艷，孫養信，范鎖平，常文輝，孫 杰，安翠紅

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌通過破損皮膚黏膜、吸入等方式侵入機體后引發的一種人獸共患的傳染病[1]。布魯氏菌病雖病死率不高但嚴重危害人民身體健康，同時嚴重影響畜牧業、旅游業、國際貿易的發展，還會帶來食品安全隱患。陜西省為國家劃定的布病一類地區，人間布魯氏菌病發病水平常年居高不下，防控形勢不容樂觀[2]。

布魯氏菌的基因組較保守，對人間布魯氏菌病分離菌株進行遺傳進化特征分析，有利于掌握各菌株之間的親緣關系，從而制定科學有效的防控措施[3]。多位點序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)技術是一種以細菌的7個或以上的管家基因進行測序，通過比對核苷酸序列發現差異，達到區分細菌型別的目的[4-7]。MLST作為一種分子分型方法，其可操作性高，分辨能力高，實驗結果可靠，便于在不同的實驗室之間進行比較，從而廣泛的應用于細菌型別和遺傳進化特征的研究[8]。本研究通過MLST對陜西省自1958年至2020年分離的77株布魯氏菌菌株進行遺傳進化分析，為更好的防控本省人間布魯氏菌病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 分離菌株信息 77株分離菌株系1958年、1973-1974年、1978年、2005年、2008年、2014-2020年分離自陜西省除漢中市外的9個地級市分別是西安市、咸陽市、榆林市、延安市、渭南市、銅川市、寶雞市、安康市、商洛市。47株為羊種3型，10株羊種1型，7株羊種2型，10株羊種變異型，2株牛種生物型，1株豬種1型。菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所鑒定和保存。

1.2 標準參考菌株信息 羊種16M、牛種544A、豬種1330S由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所惠贈，剩余13株標準參考菌株等位基因型結果來源于參考文獻[9]。

1.3 實驗儀器 生物安全柜，恒溫培養箱，高速離心機，PCR擴增儀，水平電泳儀，凝膠成像儀，移液槍。

1.4 試劑耗材 核酸提取試劑盒；超純水；2×PCR擴增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；瓊脂糖；5×TBE電泳緩沖液；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技術有限公司)；96孔PCR板；Ep管；不同規格槍頭。

1.5 菌株核酸制備 37 ℃恒溫培養箱內將分離菌株培養至對數生長期，生物安全柜內取10 μL菌落至裝有200 μL超純水的Ep管中混勻，蓋好管蓋必要時可用封口膜，放置于金屬浴中，80 ℃、1 h滅活，按照核酸提取試劑盒操作說明進行核酸提取。核酸提取結束后測定濃度(A260/A280)，-20 ℃低溫保存。

1.6 選擇MLST位點 本研究參考文獻[9]選擇9個布魯氏菌基因片段作為MLST的靶標基因：7個管家基因(gap：3-磷酸甘油醛酸脫氫酶、aroA：3-磷酸莽草酸羧乙烯基轉移酶、gyrB：DNA促旋酶B亞基、glk：葡萄糖激酶、trpE：鄰氨基苯甲酸合成酶、dnaK：伴侶蛋白、cobQ：鈷啉胺酸合成酶)、1個基因間區(int-hyp：假設蛋白基因間區)、1個外膜蛋白基因(omp25：外膜蛋白25)。

1.7 合成引物 根據9個基因片段的序列(表1)由北京擎科生物科技有限公司西安分公司進行引物合成。

表1 MLST引物名稱、序列及擴增長度

1.8 PCR擴增 擴增體系30 μL：2×PCR擴增混合液15 μL、10 μmol/L引物各1 μL、核酸模板1 μL、超純水12 μL。擴增條件：預變性(95 ℃5 min)；變性-退火-延伸(95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環)；延伸(72 ℃ 10 min)。

1.9 擴增產物分析與測序 擴增結束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增是否成功。擴增出特異性條帶的產物直接送北京擎科生物科技有限公司西安分公司進行雙向測序，獲得拼接序列。

1.10 序列比對分析 將9個布魯氏菌基因片段的拼接序列分別與MLST的標準等位基因序列進行比對(https://pubmlst.org/organisms/brucella-spp/)，確定分離菌株的ST型。利用BioNumerics(Version7.6)軟件，通過UPGMA(平均連鎖聚類法)對分離菌株進行分析，用最小生成樹(Minimum spanning tree)進行高級聚類分析，探討其進化關系。

2 結 果

2.1 生物型別 共檢測77株布魯氏菌，包括羊種1型10株，羊種2型7株，羊種3型47株，羊種變異型10株，牛種生物型2株，豬種1型1株，其中羊種3型最多，占61.04%。1958-2008年，19株布魯氏菌生物型多樣，其中羊種3型僅3株，占15.79%；2014-2020年，58株布魯氏菌中羊種3型有44株，占75.86%(表2、表3)。

表2 陜西省77株分離菌株時間分布情況

表3 陜西省77株分離菌株地區分布情況

2.2 ST比對結果 77株分離菌株比對出現3種ST型，分別為ST2、ST8、ST14。1958年和2005年各有1株牛種生物型菌株(58055、05045)結果為ST2型，1974年1株豬種1型菌株(74012)鑒定為ST14型；其余羊種菌株比對結果均為ST8型，占96.10%。2014-2020年，58株羊種布魯氏菌均為ST8型(表2)。

表4 陜西省77株布魯氏菌分離株MLST結果

2.3 BioNumerics分析結果 利用BioNumerics(Version7.6)軟件，構建聚類圖及最小生成樹，77株菌形成3個分支，ST14為1支，ST2為1支，ST8為1支，不同ST型的標準株各自形成1支。最小生成樹顯示本研究的74株布魯氏菌分離株(羊種1型、2型、3型、變異型)與標準株63/9(羊種2型)的ST型一致，聚為一簇，同種群布魯氏菌親緣關系較近，聚為一簇，說明ST型與布魯氏菌生物種型具有一定相關性。ST型與布魯氏菌傳統分型結果稍有差異，但總體上基本一致(圖1、圖2)。

圖1 陜西省77株布魯氏菌分離株MLST聚類分析

圖2 陜西省77株布魯氏菌分離株MST分析

3 討 論

陜西省屬于國家劃定的布魯氏菌病一類地區，上世紀50年代曾在我省廣泛流行，疫情嚴重地區人畜感染率達50%。20世紀80—90年代，由于加大防控力度，疫情降至歷史最低水平。近年來，隨著奶山羊、肉羊產業的大力發展，家畜飼養量不斷增加，動物及其產品流通頻繁等因素的影響，人間布魯氏菌病的發病數量不斷上升。布病不僅嚴重阻礙畜牧業發展，也危及到人民身體健康和公共衛生安全，我省的防控形勢越來越嚴峻。

對布魯氏菌分離株進行生物種型鑒定、分子分型研究、遺傳進化特征分析等可以更好地了解流行菌株之間的關聯，為合理有效的防控人間布魯氏菌病提供科學依據。布魯氏菌種型鑒定依靠的是血清凝集技術，該技術不但要求操作者要有豐富的經驗還對實驗生物安全有很大的要求。而多位點序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)就克服了以上的不足，它是一種很好地分子分型研究及遺傳進化分析的技術，是以測序為技術基礎，分辨能力高，結果準確可靠，重復性好[10-11]。MLST自1998年首次被提出來以后[12]，基于以上優勢在病原微生物領域得到了快速發展。Adrian等[9]利用MLST技術研究了30個不同國家的160株菌發現了27個ST型，國內新疆、內蒙古等也分別利用該技術對本地區的布魯氏菌分離株進行了研究[13-16]。本研究對了解陜西省布魯氏菌分離株的遺傳進化特征具有重要意義。

陜西省的布魯氏菌分離株生物種型有羊種3型、羊種1型、羊種2型、羊種變異型、牛種生物型、豬種1型，羊種3型構成比為61.04%，2005-2020年羊種3型是主要流行菌株；ST型別包括ST2、ST8、ST14，ST8型構成比為96.10%，說明ST8型是我省主要的流行菌株序列型。羊種生物型分離菌株的ST型均為ST8，說明羊種生物型菌株MLST分型比較穩定。2株ST2分別于1958、2005年從綏德、橫山人血中分離到，2株菌的分離時間前后相差47年，1株ST14型的豬種1型布魯氏菌于1972年從鄠邑鹿血中分離得到，自此也未再發現。說明MLST能夠很好的將不同種的布魯氏菌進行區分，結果可靠。1958年、1973-1979年2個時間段內分離得到15株布魯氏菌，為羊種1型6株、羊種2型7株、豬種1型1株、牛種生物型1株，未分離到羊種3型，ST型結果為ST2、ST8(86.67%)、ST14。2005-2008年、2014-2020年兩個時間段內分離得到62株布魯氏菌為羊種1型4株、羊種3型47株、羊種變異型10株、牛種生物型1株、ST型結果為ST2、ST8(占98.39%)。后兩個時間段內未再出現豬種1型及羊種2型，在今后人間布病的防控工作中應予以關注。

本研究建立了陜西省布魯氏菌MLST序列數據庫，為下一步做好布魯氏菌病的防控提供了科學依據。

利益沖突：無