花生四烯酸對小鼠日本血吸蟲病治療效果觀察

湯憲時，趙 松，熊春蓉，蔣甜甜，仝德勝，楊 坤

血吸蟲病是世界范圍內影響廣泛的寄生蟲感染性疾病，尤其在發展中國家，受影響的人口高達8億人之多[5]。血吸蟲病是由血吸蟲感染人體引起，曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲和日本血吸蟲是3種主要感染人類的血吸蟲類型，影響我國的主要是日本血吸蟲[6]。

吡喹酮是大多數血吸蟲病流行地區的首選藥物，在我國吡喹酮用于血吸蟲病治療已逾數十年。然而，在非洲一些血吸蟲病流行區出現了曼氏血吸蟲對吡喹酮耐藥的情況[7-8]，并有關于吡喹酮副作用的報道[9-11]。因此，研究開發新的血吸蟲病藥物，嘗試新的配伍用藥方法，以達到與吡喹酮類似或者更好的殺蟲效果，對于延緩血吸蟲抗藥性和血吸蟲病防控具有現實意義。

花生四烯酸是一種ω-6脂肪酸，存在于細胞膜的磷脂中，是細胞膜脂質必不可少的成分，它的4個雙鍵有助于保證分子自身的靈活性和細胞膜的流動性[1-2]。花生四烯酸在大腦和肌肉中含量豐富，對腦、視網膜和其他組織的正常發育起重要作用。花生四烯酸也是人體合成二烯類前列腺素的前體物質。作為人體必需脂肪酸，人體直接在飲食(瘦肉，蛋黃和某些魚油)中獲取花生四烯酸或者通過亞油酸體內合成[3]。雖然從食物中攝取的花生四烯酸會在體內通過環氧合酶、脂氧合酶和過氧化物酶被代謝為產生疼痛和炎癥的終產物(包括前列腺素、前列環素、血栓烷和白三烯)[2]，但是適量的外源性花生四烯酸攝入被證明是安全的，花生四烯酸已在美國和加拿大被納入配方食品中，以促進新生兒的正常發育以及運動員的肌肉生長[4]。體外和在體實驗已經證明花生四烯酸對曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲有殺蟲效果[12-13]，但花生四烯酸對日本血吸蟲是否具有類似對曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲的殺蟲作用，目前尚無相關實驗室和現場研究報道。本文旨在探索花生四烯酸抗日本血吸蟲的作用，為篩選抗日本血吸蟲新藥物和新方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品與蟲株 花生四烯酸購自Sigma公司，批號：2006090131, 純度為99.4%，密度為0.922 g/mL；玉米油購自阿拉丁試劑有限公司，批號：8001-30-7；日本血吸蟲感染性釘螺由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供。

1.1.2 實驗動物 實驗動物為5周齡雄性BALB/c小鼠(購自揚州大學比較醫學中心), 體質量為(22±2)g，10周齡雄性C57BL/6小鼠(購自揚州大學比較醫學中心)體質量為(24±2)g。實驗動物均飼養于江蘇省血吸蟲病防治研究所實驗動物中心，晝夜循環條件下飼養，自由攝取食物和飲水。

1.2 方 法

1.2.1 藥液配制 將花生四烯酸溶于玉米油，配制成花生四烯酸溶液，灌胃小鼠，按照每只小鼠300 mg/kg計算給藥質量，按照每只小鼠0.1 mL/kg計算給藥體積。

1.2.2 小鼠感染和分組

1.2.2.1 連續2 d給藥 將75只BALB/c小鼠飼養1周后，每只小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲(40±1)條。分別于感染前3 d、感染后第3 d、第7 d、第14 d、第21 d和第35 d隨機選取7只小鼠進行花生四烯酸灌胃預防或治療，連續灌胃2 d，作為給藥組。同時在各個給藥時間點，隨機選取7只小鼠以玉米油灌胃處理，連續灌胃2 d，作為溶劑組。最后剩余5只小鼠，不做任何處理，作為未處理組。

1.2.2.2 連續7 d給藥 取30只C57BL/6小鼠，每只小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲(20±1)條。分別于感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d隨機選取5只小鼠進行花生四烯酸灌胃治療，連續灌胃7 d，作為給藥組。同時在各個給藥時間點，隨機選取5只小鼠以玉米油灌胃處理，連續灌胃7 d，作為溶劑組。最后剩余5只小鼠，不做任何處理，作為未處理組。

1.2.3 樣本處理和數據計算

1.2.3.1 體內血吸蟲負擔 各組小鼠均于感染后第42 d解剖，取出小鼠肝臟和腸道，分別于小鼠腸系膜靜脈和肝臟門靜脈仔細檢查，收集蟲體，置于生理鹽水中，解剖鏡下區分雌雄并計數成蟲數量，減蟲率以公式(對照組檢獲蟲數-實驗組檢獲蟲數)/對照組檢獲蟲數×100%。

1.2.3.2 肝內蟲卵負擔 肝臟稱重，用鑷子撕碎成均勻小塊，37 ℃于5% NaOH溶液消化12 h，攪拌器中攪拌30 s，進一步打碎未完全消化的肝臟組織，依次經過60目(孔徑0.3 mm)、80目(孔徑0.2 mm)、120目(孔徑0.125 mm)標準篩過濾，去除大顆粒雜質，最后經過600目(孔徑0.025 mm)尼龍網兜過濾，用4 ℃預冷1.2% NaCl溶液將留在網兜里的蟲卵洗脫于離心管中，定容為50 mL。充分搖勻管內蟲卵，取50 μL蟲卵懸液于顯微鏡下計數蟲卵，連續計數5次，推算50 mL溶液中的蟲卵數量，即為該小鼠的肝內蟲卵數量。減卵率以公式(對照組肝內蟲卵數-實驗組肝內蟲卵數)/對照組肝內蟲卵數×100%。

1.2.4 數據統計分析 所有數據輸入Excel 2010建立數據庫、制作柱狀圖，應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。應用t檢驗進行組間差異的比較，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 連續2 d用藥對不同發育階段日本血吸蟲的作用 詳見圖1。

① P<0.05

2.1.1 體內血吸蟲負擔 未處理組小鼠體內的成蟲數量為(30±2.828)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠體內成蟲數量分別為(19.14±5.409)、(25±4)、(21.4±5.276)、(15.66±5.467)、(17.33±2.808)、(14.57±5.473)；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組小鼠體內成蟲數量分別為(23.83±2.266)、(24.8±5.979)、(18.8±2.638)、(23.2±1.6)、(23.2±6.968)、(22.75±2.947)。第14 d和第35 d，給藥組小鼠體內的成蟲數量明顯低于溶劑組(第14 dt=0.024,P<0.05，第35 dt=0.033,P<0.05)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d服藥的給藥組減蟲率分別為36.19%、16.66%、28.66%、47.77%、42.22%、51.42%；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組減蟲率分別為20.55%、17.33%、37.33%、22.66%、22.66%、24.16%,見圖2。

① P<0.01

2.1.2 肝內蟲卵負擔 未處理組小鼠每克肝臟含蟲卵數為(13 721±2 084)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠每克肝臟含蟲卵數分別為(4 032±394)、(34 193±2 400)、(21 525±2 703)、(21 495±594)、(43 335±816)、(31 175±289)；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組小鼠每克肝臟含蟲卵數分別為(10 606±1 059)、(10 153±1 196)、(11 253±1 426)、(53 693±905)、(34 483±422)、(20 953±361)。各個時間點的給藥組與溶劑組小鼠肝內蟲卵數均有統計學差異(感染前3 dt=1.967，P<0.01)(感染后第3 dt=2.875，P<0.01)(感染后第7 dt=3.383E-06，P<0.01)(感染后第14 dt=0.000 010 1，P<0.01)(感染后第21 dt=0.0248，P<0.05)(感染后第35 dt=0.000 125，P<0.01)。感染前3 d、感染后第3、7、14、21、35 d服藥的給藥組減卵率分別為70.6%、-149.19%、-56.86%、84.33%、68.41%、77.28%；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組減卵率分別為22.7%、26%、17.98%、60.86%、74.86%、84.73%。

2.2 連續7 d用藥對不同發育階段日本血吸蟲的作用 見圖3。

① P<0.05

2.2.1 體內血吸蟲負擔 未處理組小鼠體內的成蟲數量為，(13.62±2.912)。感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠體內成蟲數量分別為6±3.674、9±1.264、9.5±2.958、10±2.449、8±2.898；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組小鼠體內成蟲數量分別為9.66±0.471、7.56±4.092、6.66±1.885、8.66±2.494、13.33±1.885。只有第28 d給藥組小鼠體內的成蟲數量明顯低于溶劑組(t=0.048 7,P<0.05)。感染后第1、7、14、21、28 d服藥的給藥組減蟲率分別為55.96%、33.94%、30.27%、26.6%、41.28%；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組減蟲率分別為29.05%、44.95%、51.07%、36.39%、2.14%, 見圖4。

① P<0.01

2.2.2 肝內蟲卵負擔 未處理組小鼠每克肝臟含蟲卵數為(19 733±1 173)。感染后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d灌服花生四烯酸的給藥組小鼠每克肝臟含蟲卵數分別為(2 500±677)、(3 963±1 099)、(11 644±938)、(75 524±1 163)、(55 464±234)；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組小鼠每克肝臟含蟲卵數分別為(6 493±1 244)、(7 347±916)、(7 014±453)、(8 385±695)、(10 542±583)。第21 d給藥除外，各個時間點的給藥組與溶劑組小鼠肝內蟲卵數均有統計學差異(P<0.01)(第1 dt=0.000 022 8，P<0.01)(第7 dt=0.000 094 2，P<0.01)(第14 dt=8.916 9×10-6，P<0.01)(第28 dt=1.034 8×10-7，P<0.01)。感染后第1、7、14、21、28 d服藥的給藥組減卵率分別為87.33%、79.91%、40.98%、61.72%、71.89%；在上述給藥時間點灌服玉米油的溶劑組減卵率分別為67.09%、62.76%、64.45%、57.5%、46.57%。

3 討 論

花生四烯酸已被用于曼氏血吸蟲病和埃及血吸蟲病的防治。花生四烯酸的殺蟲的機制被認為是激活與血吸蟲軀體表皮結合的中性鞘磷脂酶(nSMase)[14-15]，導致血吸蟲鞘磷脂水解為神經酰胺和磷酸膽堿[16-17]，神經酰胺引起血吸蟲細胞膜脂質雙分子層流動性、通透性和完整性的急劇變化[18]，最后導致血吸蟲損傷和死亡。掃描和透射電子顯微鏡印證，經花生四烯酸作用后的蟲體出現細胞膜起泡和細胞膜根尖部結構紊亂[12]。細胞膜結構破壞會暴露寄生蟲體表抗原，增加其與宿主抗體結合概率，最終導致發育中的血吸蟲和成蟲體表破損，甚至死亡[19-20]。已有實驗研究報導連續15 d每天給小鼠喂飼含約300 mg/kg ARA的嬰兒配方奶粉，可使曼氏血吸蟲負擔降低60%，可使埃及血吸蟲負擔降低80%。在任何接受ARA治療的小鼠中均未觀察到不良反應[12]。曼氏血吸蟲感染的學齡兒童接受ARA(10 mg/kg·d-1)，共15 d)治療，治愈率分別為78%和85%，與PZQ配伍使用，治愈率可達100%[21]。

本研究證明日本血吸蟲成蟲對300 mg/kg花生四烯酸敏感。自感染后第35 d開始連續給藥2 d，可使Balb/c小鼠血吸蟲負擔下降約50%；自感染后第28 d開始連續給藥7 d，可使C57小鼠血吸蟲負擔下降約40%。這與一次性口服ARA治療使小鼠體內曼氏和埃及血吸蟲負擔下降31.2%至39.3%[13]的報導類似。兩個給藥組小鼠肝內蟲卵負擔降低均超過70%，進一步印證了花生四烯酸對日本血吸蟲成蟲的殺蟲作用。連續用藥7 d的減蟲率低于連續用藥2 d的原因，可能是用藥時間越靠后，蟲體越成熟，花生四烯酸對蟲體的破壞作用越顯著；也可能由于小鼠品系不同，藥物在小鼠體內代謝有差異。

雖然有體外實驗證明花生四烯酸可以對曼氏和埃及血吸蟲(包括幼蟲，童蟲和成蟲階段在內的)所有發育階段造成不可逆的損傷[12]，但是本研究發現300 mg/kg花生四烯酸對日本血吸蟲童蟲的殺蟲效果存在差異性。在感染后的前7 d內，于第3 d、第7 d連續2 d用藥，花生四烯酸的殺蟲效果與溶劑玉米油沒有明顯差別；而從感染后第1 d起連續7 d用藥，雖然用藥組的減蟲率有高于溶劑組的趨勢，但是差異無統計學意義(P>0.05)。相反地，在感染后第14 d連續2 d用藥，花生四烯酸的殺蟲率顯著高于溶劑玉米油(P<0.05)，殺蟲率達到47%；而分別從感染后第7 d、第14 d和第21 d起連續7 d用藥，花生四烯酸的殺蟲效果與溶劑玉米油的殺蟲效果無統計學差別(P>0.05)。因此，本研究不能證明300 mg/kg花生四烯酸對日本血吸蟲的童蟲有特異性殺傷作用。同時，與未處理組相比，感染前3 d預防用藥可以降低小鼠體內血吸蟲負擔，但是與溶劑組相比差異無統計學意義(P>0.05)，同樣不能證明300 mg/kg花生四烯酸對鉆入皮膚的尾蚴有特異性抑制作用。

與未處理組相比，本研究中使用的溶劑玉米油具有殺蟲效果。在不同的時間點連續2 d給予溶劑，各個溶劑組的減蟲率可達到20%～30%，在增加連續給藥至7 d，玉米油的殺蟲率進一步增加到30%～40%(感染后第35 d給溶劑除外)。玉米油的殺蟲作用的可能源于玉米油中含有一定濃度包括花生四烯酸在內的不飽和脂肪酸，因此，在本研究中只有顯著超過溶劑組殺蟲率的用藥組，才會被認為有特異性殺蟲效果。

本研究中各組小鼠肝內蟲卵計數組間差異較大，這可能與蟲卵收集等實驗操作引入的誤差有關，例如，肝臟消化、攪拌打碎以及蟲卵過濾和計數等步驟可能為蟲卵數量計算引入誤差。因此，肝內蟲卵負擔只能間接和粗略地反映小鼠體內成蟲數量的差異和變化，作為驗證小鼠體內血吸蟲負擔的輔助指標。

本研究證明花生四烯酸對抑制日本血吸蟲同樣有效。灌服300 mg/kg花生四烯酸可對成蟲期(28～35 d)日本血吸蟲造成有效損傷，使小鼠體內血吸蟲負荷降低超過40%，相應地，小鼠肝內蟲卵負荷也有明顯降低(超過70%)，證明花生四烯酸具有被用于日本血吸蟲藥物治療的潛力。在本研究基礎上，改變花生四烯酸用藥劑量和用藥時長、增加配伍用藥選擇，將更深入全面地了解花生四烯酸抗日本血吸蟲作用，同時獲得更好的殺蟲效果和更廣闊的應用前景。

利益沖突：無