東勝砂巖型鈾礦床中硫酸鹽還原菌成礦作用模擬研究

耿海波，師明川，付世騫，安麗平

1.石家莊職業技術學院食品與藥品工程系，石家莊 050081

2.河北省地礦局第六地質大隊，石家莊 050085

3.河北中醫學院基礎醫學院，石家莊 050200

4.河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，石家莊 050200

0 引言

微生物在生物圈中起著重要的作用，特別是在元素的生物轉化和生物地球化學循環、金屬和礦物轉化、分解、生物風化、土壤和沉積物形成等領域。金屬—礦物—微生物三者之間的相互作用可以被認為是地質微生物學框架內的一個重要課題，它可以簡單地定義為微生物在地質過程中的作用，此類地質微生物過程的核心是金屬和礦物轉化。微生物具有多種特性，可以影響金屬形態、流動性、礦物形成或礦物溶解等變化，這種機制是金屬的天然生物地球化學循環的重要組成部分[1-2]。

層間氧化帶砂巖型鈾礦因其礦量大、開發成本低、對環境污染小、產出效益高的特點,成為近些年國際上最有發展前景和市場競爭力的鈾礦類型，也是我國鈾礦勘查和開發的重點對象[3]。國內外對此類鈾礦研究時發現微生物在成礦過程中扮演著重要的作用，Woolfolket al.[4]在1962年的研究表明，Micrococcus lactilyticus(Veillonella alcalescens)在厭氧的條件下利用氫做電子供體發生反應，可將U（Ⅵ）還原為U（Ⅳ），美國學者Lovleyet al.[5-6]團隊研究發現硫酸鹽還原菌（SRB）和鐵還原菌可以將U（Ⅵ）還原為U（Ⅳ）并從中獲取能量。Abdelouaset al.[7]的研究發現Shewanella putrefaciens同樣對鈾具有還原作用，史維浚[8]在1989年的研究表明好氧的硫鐵桿菌能將FeS2氧化Fe（Ⅲ），進而又促進了Fe（Ⅲ）對U（Ⅳ）的氧化作用,使鈾發生強烈的水遷移。在此基礎上的研究重點主要集中在利用SRB對金屬的還原能力進行污水治理和尾礦的生物修復等方面[9-10]。國內對于鈾礦的微生物成礦作用研究主要集中在新疆十紅灘砂巖型鈾礦床，西北大學黃建新[11-13]團隊研究表明礦床圍巖和地下水中賦含SRB、氧化硫桿菌、鐵細菌、硝化細菌、反硝化細菌等多種微生物，并在成礦中扮演不同的角色。核工業203研究所喬海明[14-15]結合礦床水文地質條件的研究證明微生物的分布和數量具有明顯的球生物化學分帶性。前人對于鄂爾多斯北部東勝鈾礦的研究表明鈾礦石中具有微化石[16]，礦石中脂肪酸的研究也間接證明了生物參與了成礦過程[17]，直羅組同生沉積建造水承擔了鈾成礦的主要流體，是微生物參與成礦的環境因素[18]。

本研究團隊前期對東勝不同礦區的研究中分離得到了多種好氧和厭氧微生物，本文主要對東勝鈾礦中賦存的SRB分布進行統計，并在國內首次通過模擬實驗驗證細菌在東勝鈾礦成礦過程中的作用機制，為生物找礦和鈾污染治理提供參考。

1 地質背景

東勝地區砂巖型鈾礦賦存于侏羅系直羅組，分為上、下兩個巖性段，它們在沉積時處于兩種截然不同的沉積環境，其中下段上部為灰綠色泥巖和灰綠色砂巖，下部為灰色中砂巖,是主要鈾礦化層位，控礦地層是多期辮狀河砂體；直羅組上段為泥巖、紫紅色細砂巖和灰綠色砂巖，巖石結構疏松，砂體厚度為20～40 m。含礦層中含有較多的碳屑和植物殘骸等有機質[19-20]。含砂礦體自北向南依次發育了氧化帶—氧化還原帶—還原帶的巖石地球化學分帶。氧化帶在地表為褐黃色,鉆孔中為淺灰綠色、淺灰藍色,氧化還原前鋒線平面上總體呈東西向展布,形態為復雜的蛇曲狀；氧化還原過渡帶呈灰色、淺灰色,富含有機質和結核狀黃鐵礦；還原帶呈灰色,富含有機質,可見結晶狀黃鐵礦。鈾礦化產于層間氧化還原帶前鋒線附近,鈾礦體呈卷狀、板狀和透鏡狀[21]（圖1）。

圖1 鄂爾多斯盆地東勝地區地質略圖[21]Fig.1 Brief geological map of the Dongsheng area[21]

2 材料與方法

2.1 樣品來源與處理

研究樣品采自東勝鈾礦床直羅組下段含礦砂巖層及頂板圍巖，他們分別分布于氧化帶、氧化—還原帶和還原帶，采集后置于無菌包裝袋中帶回實驗室進行成分分析和菌類分離鑒定和成礦模擬實驗。樣品特征及其中的鈾和有機碳含量如表1所示。

表1 巖石樣品參數Table 1 Parameters of the samples

2.2 SRB的富集培養

依據參考文獻配制硫酸鹽還原菌培養基：Starkey培養基（STK）[22-23]，富集得到菌體后利用微生物方法進行分離鑒定工作。

2.3 SRB的計數

最大可能數量法（MPN法）[24]。

2.4 生長曲線的制作

依據測定硫離子濃度制作SRB生長曲線[25]。

2.5 SRB的分離、鑒定

細菌分離方法參照文獻［22?23］進行、并依據《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）進行鑒定。

2.6 實驗系統中各成分的分析測定方法

（1）巖石中鈾的測定方法

依據EJ 349.2—1988巖石中微量鈾的分析方法進行檢測。

（2）水中鈾的測定方法

依據GB/T6768—1986水中微量鈾分析方法進行檢測。

（3）巖石中有機碳測定方法

依據DZ48—1987巖石中有機碳分析方法進行檢測。

（4）pH值測定方法

依據DZ/T0064.5—1993地下水質檢測方法進行檢測。

（5）Eh值測定方法

依據DZ/T0064.7—1993地下水質檢測方法進行檢測。

（6）H2S測定方法

用醋酸鋅溶液吸收H2S，再用碘量法滴定。

2.7 SRB對鈾礦地下水質影響

為驗證SRB對鈾礦地下水中的鈾具有還原作用，從研究區三個點取地下水樣（成分分析見表2），立即放入高壓滅菌過的BOD（生物需氧量）瓶中，以防止與空氣接觸。帶回實驗室等比混合后，再按體積比例加入20%STK培養基，為SRB提供其生長代謝所需營養成分，同時可提高實驗速度，置滅菌鍋121℃滅菌30 min，消除水中其他微生物的因素干擾，冷卻后在超凈工作臺分別接種分離得到的各種SRB，以比較它們對鈾的還原能力。同時做無菌實驗液空白對照，以排除STK培養基的非生物因素干擾。用無菌液體石蠟隔氧情況下28℃恒溫靜置培養，45天后進行檢測。

表2 鈾礦地下水成分分析Table 2 Analysis of groundwater composition in uranium deposit

2.8 SRB對鈾的固定機制實驗

2.7實驗完成后，取部分菌液，用離心機4000rpm離心20 min，獲取細胞后檢測菌體細胞攜帶的鈾含量。

2.9 SRB—水—巖成礦模擬實驗

為模擬礦床天然狀態下菌—水—巖的生物地球化學反應在成礦中的作用，分別在表1不同巖石樣中按照固液比1:1加入地下水混合液，121℃滅菌30 min后，定量接入SRB混合菌液；同時做無菌的水—巖空白對照，以排除實驗體系中非生物因素的干擾。用無菌液體石蠟液封后置28℃恒溫靜置培養，60天后對各成分進行檢測。

3 結果與討論

3.1 各亞帶巖石樣品中SRB的分布

對各亞帶巖石樣品中的SRB種類分布和菌株數量進行研究。結果見表3。

表3 鈾礦巖石樣品中SRB分布Table 3 Distribution of SRB in the uranium deposit

從鈾礦巖石樣品中共分離得到了68株SRB，對它們分純后鑒定至種，可知它們分別屬于脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的脫硫脫硫弧菌（D.densulfuricans）和普通脫硫弧菌（D.vulgaris），以及脫硫腸狀菌屬的（Desulfotomaculum）的東方脫硫腸狀菌（D.orientis）（圖2）。其中D.densulfuricans和D.vulgaris尺寸為（0.5～1）×3μm，彎桿狀或弧形，單端叢生鞭毛，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性，有機化能異養菌，以厭氧呼吸還原硫或其它可還原的硫化合物為H2S獲取能量，能使含鐵鹽的培養基變黑，常和沉淀的FeS有關，在含有過量亞鐵鹽的硫酸鹽洋菜中，可產生全黑的圓形菌落，最適生長溫度25℃～30℃，但與菌體所生環境有關。D.orientis呈直桿狀，約3μm×6μm，周生鞭毛，為嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌，同樣可在含硫酸鹽培養基中可產生H2S，最適生長溫度35℃～55℃，最高可達70℃，可在30℃以下生長。

圖2 SRB顯微攝像圖（×1000）Fig.2 Microphotographs of SRB（×1000）

從表3中數據可以看出，三者分布具備一定的生物地球化學分帶性，D.densulfuricans主要分布于氧化帶和氧化—還原帶，還原帶未有分布，D.vulgaris僅在氧化帶有分布，而D.orientis在三個亞帶均有分布，而且數量相比較前兩者更大。結合它們各自的理化特點可以發現，兩個屬的菌差別主要在最適生長溫度和是否可產生芽孢兩方面，每種微生物都有自己的最適生長溫度，D.orientis具有更寬的最適溫度范圍，同時對于高溫的耐受能力明顯強于D.densulfuricans和D.vulgaris，而對于高溫的耐受能力和其自身可產生芽孢有關，芽孢的獨特結構有助于菌體抵抗高溫、電離輻射和有毒成分等不良環境，為菌體能在礦床的廣泛存在提供了保障，不具備芽孢結構的菌體，在遇到不適合自身生長的環境時，其適應力明顯不足，尤其是在還原帶含鈾量高的環境，鈾的毒性和電離輻射導致其在還原帶不易存活。另外菌體的分布也和礦石的含碳量有關，氧化帶有機碳含量豐富，為各種SRB的生長繁殖提供了物質基礎，所以菌體種類較多。

3.2 SRB對地下水中鈾的還原結果分析

從表4中實驗數據可以看出，無菌的STK本身可影響鈾的還原率，扣除此非生物因素后，仍然可以明顯看到SRB對鈾的還原作用，菌體利用STK中的營養成分繁殖，在代謝過程中導致環境pH上升，Eh下降，產生H2S。三個有菌實驗體系比較而言，還原能力最強的為D.orientis，這是因為其菌體結構決定了其具備更強的環境適應能力，保證其大量增殖后具備群體的數量優勢，是東勝鈾礦床中的優勢種群。

此實驗證明微生物的活動可以通過改變自然水環境的化學性質（pH、氧化還原電位，H2S），通過產生還原作用或通過直接在細胞上或細胞內積累來影響鈾的狀態[26]。

為研究分離到的三個種的菌株的生長規律，在實驗過程中，每隔5天檢測試驗系統中菌體數量，求對數后對時間做菌體對數生長曲線，如圖3所示，從圖中可知分離純化后的SRB可能因失去了共生微生物的協同作用，它們在地下水中生長繁殖速度相對常見微生物要慢，延滯期為10～20天，D.orientis因具有芽孢結構，適應力較強，延滯期相對較短，大約10天后菌體適應了含鈾環境，進入增速很快的對數期，并且將數量優勢一直保持到試驗結束，這和它導致的鈾的高還原率的實驗結果相符；對數期是菌體最為活躍的時期，代謝活躍，新生成的數量遠大于死亡的數量，它們充分利用環境中的營養成分合成自身所需成分；隨著菌體數量的增加和環境中營養成分的降低，新生成的菌體數量和死亡的菌體逐漸呈現動態平衡，活菌數達到最高峰，此時期是菌群對環境改造能力最強的時期；隨著時間推移，環境中營養成分已經不足以滿足菌體的大量需求，同時菌體代謝后形成的副產物越來越多，菌體進入衰亡期，并最終完成完整的生命周期。需要說明的是，實驗設計的系統為靜止和封閉的環境，不存在和外界的物質和能量傳遞，和天然狀態下的動態穩定的環境存在較大差別，這種差別類似于微生物的分批培養和連續培養。自然狀態的環境處于相對動態的平衡，可為SRB持續的提供營養成分，同時把有害物質稀釋，其穩定期會持續更久，所以它們對成礦的貢獻應大于模擬實驗檢測的數據。

圖3 SRB生長曲線（SRB含量隨時間的變化情況）Fig.3 SRB growth curve(SRB content changes vs.time)

3.3 SRB對鈾的固定機制結果分析

研究表明，微生物群體有固定金屬的能力。不同微生物固定金屬的機制主要包括：1）沉淀代謝物于細胞內或者細胞表面及胞外聚合物內；2）與表面吸收或離子吸附有關的被動積累；3）與磷酸鹽等無機配體反應沉淀；4）促進不溶化合物沉淀于細胞外部；5）還原可溶性金屬形成無機礦物[27-29]。

為驗證SRB在成礦中的機制，將還原鈾實驗液經離心后收集細胞，檢測鈾在菌體細胞內外的攜帶量，數據表明菌體細胞中鈾的攜帶量僅為液體中鈾減少量的10%左右，再排除純化學作用在成礦中的影響因素，基本可以確定SRB通過產生的H2S的還原作用，促使鈾從地下水向巖石中沉淀富集，是微生物成礦中的主要影響因素。

SRB適合在pH中性或偏堿性的環境中存在。它們以環境中賦存的有機質作為氧化介質，氧化放出的電子將周圍的SO2-4還原為H2S，從中獲取其生長繁殖和代謝所需要的能量[30]。產生的H2S能將U(VI)還原為U（IV）。

這種菌—鈾相互作用機制的存在，不僅通過氧化還原或改變流動性、溶解度來改善鈾的環境分布，而且保證了微生物在不斷變化的環境中的適應性。所有這些相互作用機制最終改變了鈾的流動性[31]。

3.4 SRB—水—巖成礦模擬實驗結果分析

從表5中數據可以看出，6個礦石樣分別做了有菌/無菌對照試驗，有菌組對照無菌組數據進行比較，鈾的還原率明顯更高，對有菌實驗組菌數量級進行定量計算，發現6組中的菌數均呈現數倍增長，說明SRB可以利用巖石中賦存的營養成分進行生長繁殖，在其生命過程中改變環境諸多因素，如pH上升、氧化還原電位下降、產生H2S氣體等有規律可循的現象，而無菌對照組各數據實驗前后未發現明顯改變。

表5 SRB對U(VI)的還原作用Table 5 Reduction of U(VI)by SRB

對6組有菌模擬實驗系統橫向對比可以發現，前三組模擬系統中菌數增長相對較多，后三組有增長但相對較少，結合巖石樣成分及SRB生理特點進行分析，這些細菌在還原反應中多利用有機物作為電子供體，也有一些利用氫作為電子供體，因此巖樣中有機物含量在一定程度上影響著SRB的生長和繁殖；同時菌體數目和鈾含量呈反比，可見鈾的濃度對SRB有一定影響。盡管鈾對大部分生物有明顯的毒性和放射性，但是在研究中發現許多微生物仍能存活，尤其是具芽孢的D.orientis，可在富含鈾的環境中大量繁殖，應為長期共存對環境的適應后不斷進化的結果。除具備被動適應能力外，SRB還通過自身生化反應來主動改變鈾的可溶狀態，促使菌體周圍微環境中鈾濃度減小，達到自我保護的目的，此過程導致鈾的流動性減少并最終沉積于巖石中。這種金屬元素在可溶相和不可溶相之間的轉變也是金屬生物地球化學的核心，為微生物反應和元素循環之間提供了直接的聯系。由此可見，微生物與鈾的相互作用是極其重要的，并且在成礦作用方面，成為除物理和化學外的第三大重要因素[32]。

4 結論

礦物和巖石是微生物在各種維度上相互作用的最基本的地球物質，礦物質和巖石為微生物提供了營養和棲息地，微生物在與離子或者礦物元素及有機物的得失電子的作用（氧化還原作用）中完成它自己的新陳代謝活動進而得以生存，是地質化學過程中活躍物質的生產者和消費者，它們通過對礦物溶解度和物質遷移來影響巖石和礦物的風化和成巖作用。

（1）通過對東勝砂巖型鈾礦床中最主要的微生物類型——SRB的賦存種類以及它們在成礦過程中的模擬實驗，發現SRB的分布與礦床分帶性和圍巖環境中各因素有密切關系，環境中營養物為菌體生長繁殖的限制因子，SRB通過與礦床長期共存提高了自身對不良環境的適應能力，還能從環境中汲取所需營養時通過自身生化反應主動改變鈾的價態和溶解度，改善菌體所處環境的微生態，最終促使了鈾元素從地下水向巖石的沉淀、析出和礦化。

（2）成礦作用包括了物理成礦、化學成礦和生物成礦以及它們的協同作用，微生物在成礦過程中發揮了多大的作用，還有待于通過多因素模擬實驗進一步研究。微生物和物理、化學因素的協同成礦作用豐富了國內砂巖型鈾礦成礦的理論，對于通過微生物分布規律找礦、鈾礦地浸開采和退役鈾礦地下水污染治理同樣具有參考價值。