高效液相色譜法測定蘇打水中安賽蜜含量的不確定度評價

李 璐 張 哲 邊 廣 劉 冰

(泰安市疾病預防控制中心， 泰安 271000)

1 前言

為了提高測量結果表達的準確性和評定結果質量，本文依據GB/T 5009.140-2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》，采用高效液相色譜法測定了蘇打水中安賽蜜的含量，并根據JJF1059.1-2012 《測量不確定度評定與表示》對其含量的不確定度進行了分析。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

蘇打水 市售；苯甲酸溶液標準物質(1000 μg/mL)， GBW(E) 100167 1805；甲醇(CH3OH)， 色譜純；硫酸銨((NH4)2SO4)優級純；硫酸 (H2SO4)分析純；乙腈(CH3CN)色譜純；超純水(Ω=18.2) 。

2.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀(Ultimate 3000)；電子天平(ALC-210.4)；超聲清洗儀(KQ3200DE)；超純水機(CASCADA I)；微孔濾膜(QYGL-002)。

2.3 實驗方法

2.3.1樣品處理

按照GB/T 5009.140-2003 《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》對樣品進行處理。準確稱取約2 g(精確到0. 001 g)試樣于50 mL容量瓶中，加超純水至刻度，混勻后將試樣放入超聲清洗儀中超聲脫氣。取適量溶液通過0. 45 μm濾膜，濾液作HPLC分析測定用。

2.3.2標準溶液配制

準確吸取安賽蜜溶液標準物質2.00 mL于50 mL容量瓶中，用超純水定容，配制濃度為40.0 μg/mL安賽蜜標準中間溶液。分別準確吸取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL苯甲酸標準中間溶液，用超純水定容至10 mL，配制成濃度分別為4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、12.0 μg/mL、16.0 μg/mL、20.0 μg/mL的標準系列工作溶液。

2.3.3色譜條件

色譜柱：Acclaim?120 C18柱(柱長250 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm)，柱溫：25℃；流動相：0.02 mol/L硫酸銨溶液(800 mL)+甲醇(150 mL)+乙腈(50 mL)+10%硫酸溶液(1 mL)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器，檢測波長：214 nm；進樣量：10μL。

3 不確定度來源分析

依據標準GB/T 5009.140-2003 《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》，樣品中安賽蜜含量的計算公式為：

其中x為樣品中安賽蜜含量(mg/kg)；ρ為由標準曲線得出的樣品溶液中安賽蜜的濃度(μg/mL)；V為樣品定容體積(mL)；m為樣品質量(g)。

從樣品質量、樣品溶液體積和樣品溶液濃度3個方面，分析測定安賽蜜含量的不確定度來源主要有樣品稱量、樣品溶液配制、標準溶液配制、儀器的響應值和加標回收率等方面[6-10]。

4 不確定度分量的評定

4.1 樣品稱量引起的相對標準不確定度urel(m)

用德國Acculab ALC-210.4電子天平準確稱取約2 g樣品，精確到0. 001 g，根據電子天平校準證書的信息，Urel=0.0003g(k=2)，由此可計算樣品稱量引起的相對標準不確定度為：

4.2 樣品溶液定容過程中引起的相對標準不確定度urel(V)

將準確稱取的樣品轉移至50 mL容量瓶中，加入超純水至刻度。此過程中使用的玻璃器具和溫度均會引起測量結果的不確定度。

4.2.1樣品溶液定容過程中玻璃量具引起的相對標準不確定度urel(V1)

4.2.2樣品溶液定容過程中溫度引起的相對標準不確定度urel(T1)

實驗過程中所用玻璃量具是在20℃時校準，實驗室溫度則一般在20±5℃，由于玻璃量具受溫度的影響很小，因此可以忽略不計。

本實驗中所用溶劑為超純水，水的膨脹系數為a=2.08×10-4/℃，因此樣品溶液配制過程中溫度引起的相對標準不確定度為：

由上述可以計算樣品溶液定容過程中引起的相對標準不確定度:

4.3 標準溶液配制引起的相對標準不確定度urel(C)

4.3.1標準物質引起的相對標準不確定度urel(std)

安賽蜜溶液標準物質證書顯示，其標準值為1000 μg/mL，擴展不確定度為2%(k=2)。則標準物質引起的相對標準不確定度為：

4.3.2標準溶液配制過程中玻璃量具引起的相對標準不確定度urel(V2)

表1 標準溶液配制過程中玻璃量具引入的不確定度

標準溶液配置過程中玻璃量具引入的合成相對標準不確定度為：

4.3.3標準溶液配制過程中溫度引起的相對標準不確定度urel(T2)

忽略溫度對玻璃量具的影響只考慮溫度對溶劑的影響。實驗中的溶劑是超純水(a=2.08×10-4/℃)，則標準溶液配制過程中溫度引起的相對標準不確定度為：

=0.147%

由上述可以計算標準溶液配制過程中引起的相對標準不確定度:

4. 4 標準校準曲線擬合引起的相對標準不確定度urel(q)

將標準系列工作溶液重復測定3次，測定所得到的峰面積以及擬合標準溶液濃度-峰面積曲線如表2所示。

表2 標準系列工作溶液測定結果

測量所得峰面積的標準偏差為：

=0.0861

在樣品的實際檢測過程中，重復測量樣品2次(p=2)，兩次測得峰面積分別為5.0803和5.1302mAU*min，應用曲線方程Y=-0.1309+0.4839X，計算得樣品中安賽蜜的濃度分別為10.769和10.872 μg/mL，其平均值為10.820 μg/mL。由此校準曲線擬合引起的相對標準不確定度為：

式中，C0為樣品中安賽蜜的實際測量濃度(μg/mL)；為標準系列溶液濃度的平均值(μg/mL)；b為擬合工作曲線的斜率；Ci為標準溶液濃度(μg/mL)；n為總進樣次數。

由上述計算過程可以看出，校準曲線擬合的標準不確定度包含了標準溶液重復測量產生的不確定度、儀器自身數據處理系統引入的不確定度和標準溶液進樣量的不確定度。

4.5 樣品溶液重復測量引起的相對標準不確定度u rel(x)

樣品溶液重復測量的不確定度主要是由樣品的均勻性和儀器本身性能因素引起的，屬于不確定度的A類評定。將同一樣品溶液重復測定9次，測定的峰面積如表3所示。

表3 樣品溶液重復測量結果

由表3中數據可得峰面積的平均值為5.1054 mAU*min，根據JJF1059.1-2012 《測量不確定度評定與表示》中標準不確定度的A類評定方法，采用貝塞爾公式計算峰面積單個測量值的實驗標準偏差為：

由此可計算樣品重復測量引起的相對標準不確定度為：

4.6 回收率校正因子引起的相對標準不確定度urel(frec)

在實驗過程中，由于人員操作、所用器具和設備等原因，樣品處理后安賽蜜含量會有所改變，實驗采用對不含安賽蜜的樣品中加入高、中、低3個濃度水平的安賽蜜標準物質進行檢測，測定結果和回收率計算結果如表4。

回收率的標準偏差為：

回收率因子引起的相對標準不確定度為：

表4 加標回收率測定結果

5 相對標準不確定度的合成及擴展

5.1 合成相對標準不確定度

用高效液相色譜法測定白醋中苯甲酸含量時，可引起不確定度的因素及其對應的不確定度分量匯總如表5，由此可得苯甲酸含量的合成相對標準不確定度為：

表5 各分量相對標準不確定度匯總表

5.2 擴展不確定的評定和檢測結果表示

取置信區間p=95%，k=2，則蘇打水中安賽蜜測定的相對擴展U=k×ucrel(X)=0.0400

本文中測得樣品中安賽蜜最佳估計濃度為270 mg/kg，因此其擴展不確定度為，樣品中安賽蜜的測定結果為X=270±11 mg/kg，(k=2)。

6 結論

用高效液相色譜法測定蘇打水中安賽蜜的含量，從樣品質量、樣品溶液體積和樣品溶液濃度3個方面分別分析了影響測量結果不確定度的來源，主要有樣品稱量、樣品溶液定容、標準溶液配制、標準校準曲線擬合、樣品重復測量以及回收率校正因子，并分別對其進行量化和合成，；最終計算出安賽蜜測量結果相對標準不確定度為2.00%，擴展不確定度為11 mg/kg，因此本實驗用高效液相色譜法測定蘇打水中安賽蜜的含量為270±11 mg/kg (k=2)。影響檢測結果不確定度的主要因素是標準物質、玻璃量具、 標準校準曲線擬合、重復測量和回收率校正因子。因此在實際測量過程中，應該選用準確度高的標準物質和玻璃量具，增加標準系列工作溶液的測量次數以及規范實驗操作步驟等方式提高測量結果的準確性。