超高效液相色譜法測定杞菊地黃丸中23-乙酰澤瀉醇B的含量及不確定度評估

(石家莊市食品藥品檢驗中心，石家莊 050011)

杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等8味中藥組成。方中澤瀉為佐使藥，瀉腎降濁，與君藥臣藥相結(jié)合，發(fā)揮滋腎養(yǎng)肝明目的功效，在方劑中發(fā)揮了重要藥理作用。澤瀉中的23-乙酰澤瀉醇B為三萜類化合物，是發(fā)揮澤瀉藥理作用的主要成分[1]。目前關(guān)于杞菊地黃丸的質(zhì)量標準研究更多地是關(guān)于莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測定[2-5]，對其他藥味的含量研究較少。本文參考相關(guān)文獻研究建立了超高效液相色譜法(UPLC)測定杞菊地黃丸中澤瀉指標成分23-乙酰澤瀉醇B 的含量。并依據(jù)JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[6]、JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]及參考其它的相關(guān)文獻[8-12]分析各不確定度來源，對測量過程的不確定度進行分析。為質(zhì)量控制和檢驗結(jié)果的準確性評估提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters UPLC H-Class型超高效液相色譜儀(PDA檢測器)；梅特勒-托利多電子天平；Elmasonic P 超聲波清洗儀；Milli-Q超純水儀。

23-乙酰澤瀉醇B(批號111846-201203，純度99.5%)；杞菊地黃丸(大蜜丸)(批號17010781)；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水(超純水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流動相：乙腈-水(54∶46)；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：208 nm；柱溫35 ℃；進樣體積：2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取23-乙酰澤瀉醇B對照品10 .09mg，精密稱定后置于200 mL量瓶中，加入適量80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取上述儲備液10 mL，置100 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取杞菊地黃丸，剪碎，取約2.0 g，精密稱定后置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷后再稱定重量，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)驗證試驗

2.4.1專屬性考察

按照杞菊地黃丸處方和生產(chǎn)工藝制備缺澤瀉的陰性樣品，照“2.3”項下所述方法制備陰性對照樣品溶液，按照“2.1”項下所述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，樣品中23-乙酰澤瀉醇B 分離良好，陰性樣品在23-乙酰澤瀉醇B峰相對應(yīng)的保留時間無色譜峰(圖1)。

圖1 專屬性液相色譜圖1.23-乙酰澤瀉醇B；A .23-乙酰澤瀉醇B對照； B.供試品 C.缺澤瀉陰性供試品

2.4.2線性關(guān)系考察

將“2.2”項下所述儲備液用80%甲醇分別制成每1mL含23-乙酰澤瀉醇B 1.07 μg、2.13 μg、5.33 μg、10.66 μg、21.32 μg、50.30 μg的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。23-乙酰澤瀉醇B的線性回歸方程為Y=3818.3X-1648(r= 0.9997)，結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B在1.07～50.30 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度考察

吸取“2.2”項下所述23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液，照“2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，23-乙酰澤瀉醇B的峰面積的RSD為0.73%。

2.4.4穩(wěn)定性考察

取2.4.5項下供試品1份，照2.1項下所述色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24h進樣，記錄色譜圖，23-乙酰澤瀉醇B的峰面積的RSD值為1.48%。

2.4.5重復(fù)性考察

取杞菊地黃丸供試品(批號：17010781)，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，測得6份樣品23-乙酰澤瀉醇B的含量RSD值為1.39%。

2.4.6準確度考察

取杞菊地黃丸供試品(批號17010781)約1.0g，精密稱定，共9份，按“2.3”項下方法制備低、中、高濃度加樣回收樣品各3份，并測定，計算回收率。結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率為99.8%，RSD為1.9%。

2.5 結(jié)果

本試驗通過對比不同的提取溶劑、提取時間及提取方法[13-17]，考察不同流動相種類與配比[18]，最終確定了上述含量測定方法。該方法專屬性強、準確度高，重現(xiàn)性好，可作為杞菊地黃丸中澤瀉的質(zhì)量控制方法。

3 不確定度分析

3.1 數(shù)學(xué)模型的建立及不確定度來源分析

按外標法建立23-乙酰澤瀉醇B含量測定公式：

式中

Y：供試品中23-乙酰澤瀉醇B含量，μg·g-1；

Ax：供試品峰面積；

AR：對照品峰面積；

mx：供試品的稱樣量，g；

mR：對照品的稱樣量，mg；

PR：對照品的純度；

Vx：供試品的稀釋體積，mL；

VR：對照品的稀釋體積，mL。

由公式可得，Ax、AR、mx、mR、PR、Vx、VR為含量測定的不確定度來源，且各分量互不相關(guān)。

3.2 測量不確定度各分量的評定

3.2.1對照品的純度引入的相對不確定度urelYPRY

3.2.2對照品的稱樣量引入的相對不確定度urelYmRY

3.2.2.1天平最小分辨率的標準不確定度

對照品稱量采用梅特勒公司XS105型天平(d=0.01)，最大允許誤差0.1mg，依據(jù)B類評定規(guī)則，按矩形分布計算：

3.2.2.2最大允許誤差的標準不確定度

天平計量檢定證書所示，該天平最大允許誤差為0.04 mg，依據(jù)B類評定規(guī)則，按矩形分布計算：

實際對該品種進行檢驗時，對照品稱樣量為10.09mg，則對照品稱量的相對標準不確定度：

3.2.3供試品稱樣量引入的相對不確定度urelYmxY

此分量的不確定度分析同對照品“3.2.2”，供試品稱樣采用直接稱定，則

=6.22×102mg

供試品稱取2份平行樣，分別為2004.8 mg與2003.2mg，則

3.2.4對照品配制過程由體積引入的不確定度μrel(VR)

其不確定主要是由配制過程中量器校準和溫度引入。

中共中央黨校(國家行政學(xué)院)教授車文輝以《生態(tài)文明視域下的鄉(xiāng)村振興》為題，重點闡述了鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略實施過程中的生態(tài)文明建設(shè)問題，指出了鄉(xiāng)村建設(shè)、經(jīng)濟開發(fā)進程中忽視生態(tài)、破壞生態(tài)的現(xiàn)象以及帶來的嚴重后果，提出生態(tài)建設(shè)、生態(tài)保護是鄉(xiāng)村振興題中應(yīng)有之義，生態(tài)文明好不好決定著鄉(xiāng)村振興的質(zhì)量。

3.2.4.1量器校準引入的不確定度

本次對照溶液的配制過程用到200mL 、100mL單標量瓶及10mL單標吸管，且均為A級。通過查看JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知200 mL、100mL單標量瓶及10mL單標吸管(A級)容量允許誤差分別為±0.15 mL、±0.10 mL、±0.020 mL。量器校準按三角分布計算，以上3種配制量器的校準引起的相對不確定度為：

=3.70×104

3.2.4.2溫度引入的不確定度

玻璃量器的校準溫度為20℃，實驗室溫度一般為25℃，25℃下80%甲醇的膨脹系數(shù)為9.86×10-4，屬于B類不確定度，按矩形分布計算，對照品配制過程中由溫度引入的不確定度為：

則對照品稀釋過程中引入的不確定度為：

3.2.5供試品溶液配制過程中由體積引入的不確定度μrel(Vx)

此不確定度分析同對照品稀釋過程“3.2.4”，供試品溶液配制過程中用到20mL單標吸管(A級)，其容量誤差為±0.030mL,則

樣品稀釋過程中引入的不確定度為：

=2.85×103

3.2.6對照品峰面積引入的不確定度μrel(AR)

峰面積重復(fù)性誤差屬于隨機誤差，屬于測量不確定度的A類評定。本次試驗精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品1份，平行進樣2次，測定色譜峰面積，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的峰面積分別為18666、18584，兩者差值R=92，平均峰面積18625，采用極差法計算，當(dāng)n=2時，極差系數(shù)C=1.13，則對照品峰面積引入的相對不確定度為：

3.2.7供試品溶液峰面積引入的相對不確定度urelYAxY

此分量的不確定度分析同“3.2.6”， 供試品為兩個平行樣品，分別連續(xù)進樣2次測定其峰面積，測定結(jié)果見表1。

表1 供試品峰面積測定結(jié)果

則供試品峰面積引入的不確定度：

=5.70×103

3.3 合成相對標準不確定度及擴展不確定度的計算

測量結(jié)果符合正態(tài)分布，包含概率為95%時，包含因子k=2，相對擴展不確定度urel=kU=2×1.27×102=2.54×102

表2 各分量的相對標準不確定度

本實驗中，UPLC法測定杞菊地黃丸中23-乙酰澤瀉醇B含量測量結(jié)果表示為57.2±0.0254μg·g-1，k=2。

4 結(jié)論

研究了UPLC法測定杞菊地黃丸中23-乙酰澤瀉醇B的含量，方法專屬性強高，靈敏度高，重復(fù)性好，為杞菊地黃丸質(zhì)量控制提供了參考。同時本文還對該方法不確定度各分量的數(shù)值進行評估，表明對照品稱量引入的不確定度最大，應(yīng)考慮選擇精度更高的天平，或增大對照品的稱樣量和稱量份數(shù)；本試驗可為類似的研究提供參考。