反硝化微生物燃料電池脫除低C/N廢水中氮的研究*

賈 婧 彭俊霖 王一靖 李 楊 李筱晗 吳文斌 付樹森 袁青彬

(南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 211816)

近年來，我國地表水和很多生活污水均呈現(xiàn)有機物含量較低而氮磷含量較高的特征[1-3]。由于碳源不足，采用生物法進行反硝化脫氮時效果較差，成為此類水處理的一大難點，因而針對性地開發(fā)低C/N廢水脫氮處理技術(shù)勢在必行。

本研究從C/N在3.4以下的低C/N廢水中分離出3株可富集培養(yǎng)、脫氮產(chǎn)電效率高的菌種，考察了菌種的生理特性、脫氮效率及其用于反硝化MFC的可行性。開發(fā)能夠在低C/N條件下高效脫氮的反硝化MFC，實現(xiàn)脫除污染物的同時產(chǎn)生能源，可為高氮低有機物廢水處理提供參考數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

模擬廢水：KH2PO422 mg/L(折合TP 5 mg/L)，MgSO4·7H2O 10 mg/L，CaCl210 mg/L，NaCl 10 mg/L，KNO3180.5 mg/L(折合TN 25 mg/L)，CH3COONa 170.8 mg/L(折合總碳(TC)50 mg/L)，微量元素溶液 0.5 mL/L。

低碳源反硝化培養(yǎng)液：檸檬酸三鈉 2.5 g/L，KNO3757.5 mg/L(折合TN 105 mg/L)，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO41 g/L，pH 7.0～7.5。

低碳源反硝化固體培養(yǎng)基：乙酸鈉1.4 g/L，KNO32 000 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

實驗中所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 反硝化細菌的篩選與反硝化性能測定

從某污水處理廠的新鮮活性污泥中分離篩選反硝化菌種，將活性污泥經(jīng)梯度稀釋后在低碳源反硝化固體培養(yǎng)基上劃線分離，反復(fù)分離多次后挑選單一菌落富集培養(yǎng)，得到3株反硝化菌，分別編號為M1、M2、M3，對其16S rDNA序列進行測序，在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比較，通過MEGA軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

利用低碳源反硝化培養(yǎng)液于37 ℃對M1、M2、M3菌株分別培養(yǎng)48 h，每12 h測定培養(yǎng)液中TN的含量，計算3種菌株的脫氮率。

1.3 反硝化MFC的運行

本實驗采用雙極室MFC構(gòu)建反硝化MFC，反應(yīng)室由有機玻璃制成，有效容積為200 mL，陰極和陽極選用碳氈電極，碳氈電極經(jīng)活化處理，長度5 cm，寬度1 cm。反硝化MFC由納濾質(zhì)子交換膜中間分隔，外部連接10 Ω電阻。將模擬廢水置入雙極室MFC中，分別加入3種富集培養(yǎng)的反硝化菌株啟動反硝化MFC以測試其性能。調(diào)節(jié)每種反硝化細菌濃度為105cfu/mL，維持溫度在32 ℃[9]，每隔10 min測量電壓，當(dāng)電壓下降到20 mV以下時更換模擬廢水，此過程為一個周期，每周期約3 d，反復(fù)3個周期后若電壓保持穩(wěn)定，認為反硝化MFC啟動成功。

待反硝化MFC啟動成功后，提高模擬廢水中KNO3使TN初始質(zhì)量濃度約250 mg/L，相應(yīng)調(diào)整CH3COONa濃度，使模擬廢水C/N保持在2.0，利用1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)的NaOH調(diào)整pH到7.5，取5 mL濃度為105cfu/mL的菌液，8 000 r/min離心后去除上清液，將下層富集的菌體投入反硝化MFC中進行補充，其他條件保持不變，連續(xù)運行80 h，考察反應(yīng)室內(nèi)TN變化。由于反硝化MFC啟動時存在一定電壓，此時加入菌液會對MFC有所擾動，電壓波動較大，因此將30 min后稍穩(wěn)定的電壓作為初始電壓，開始時每10 min測定一次，待電壓穩(wěn)定后每16 h測定一次，評估3種菌株的產(chǎn)電性能。

1.4 反硝化MFC的影響因素

在pH為7.5時，提高模擬廢水中KNO3使TN初始質(zhì)量濃度為400 mg/L，調(diào)節(jié)CH3COONa投加量使C/N分別為5.0、2.0、1.0、0.5，其他物質(zhì)濃度不變。將不同C/N水平的模擬廢水分別注入反硝化MFC，取5 mL M1菌液(105cfu/mL)于8 000 r/min離心后棄去上清液，將下層的富集菌體投入反硝化MFC，在32 ℃下持續(xù)運行80 h，記錄MFC維持穩(wěn)定運行狀態(tài)下的電壓，并考察TN變化，以計算脫氮率。

1.3 指標(biāo)判定 用MMSE量表評估患者術(shù)后認知功能，包含語言能力、回憶力、計算力、注意力、記憶力、定向力等方面，正常：27-30分，輕度障礙：21-26分，中度障礙：10-20分，重度障礙：＜10分。記錄其麻醉前、手術(shù)開始時、術(shù)中0.5h、手術(shù)完成時，患者平均動脈壓、心率，以及術(shù)后睜眼時間、拔管時間，并比較。

控制模擬廢水中KNO3、CH3COONa投加量使TN初始質(zhì)量濃度為400 mg/L、C/N為2.0，用1%的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)室內(nèi)pH分別為7.5、8.5、9.0、9.5、10.5，其他物質(zhì)濃度與模擬廢水保持一致。取5 mL M1菌液(105cfu/mL)于8 000 r/min離心后棄去上清液，將下層的富集菌體投入反硝化MFC，在32 ℃下持續(xù)運行96 h，連續(xù)記錄反應(yīng)室內(nèi)電壓及TN變化，計算脫氮率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

經(jīng)測序并在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中比對，實驗所得的3株好氧反硝化菌均屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。利用MEGA軟件構(gòu)建M1、M2、M3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。從圖1可以看出，M1、M3菌株更加接近，與二者親緣關(guān)系最近的是PseudomonasM1、M3菌株屬橄欖綠假單胞菌潤滑亞種(Pseudomonasoleovoranssubsp. lubricantis)。其中M1菌株表現(xiàn)出該亞種的明顯特征，即其在反硝化固體培養(yǎng)基中呈白色圓形菌落狀，略帶褐綠色，表面光滑、黏稠，在反硝化液體培養(yǎng)基里呈綠色；M3菌株未表現(xiàn)出該特征。該亞種曾用于紡織廢水的毒性評價與生物修復(fù)[10]，在反硝化MFC中尚未見報道。M2菌株屬門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)，在已有的研究中被證實屬于異養(yǎng)硝化菌，其在反硝化固體培養(yǎng)基中菌落呈白色，圓形，表面光滑、黏稠，在反硝化液體培養(yǎng)基中呈乳白色。

圖1 M1、M2、M3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic dendrogram of M1, M2 and M3

oleovoranssubsp. lubricantis strain RS1，其16S rDNA序列同源性為99.79%；而與M2菌株親緣關(guān)系最近的則為Pseudomonasmendocinastrain DS04-T，兩者16S rDNA序列同源性為99.51%。

2.2 菌株反硝化性能

3株反硝化菌在低碳源反硝化培養(yǎng)液中TN變化見圖2。實驗過程中，M1、M2、M3菌株48 h的脫氮率分別為81.27%、76.66%、82.89%，與前人報道菌株的脫氮性能相近。楊靜丹等[11]研究表明一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌HY3-2對硝酸鹽的去除率為88.11%；而苑宏英等[12]利用序批式反應(yīng)器所構(gòu)建的生物反硝化系統(tǒng)中，TN去除率最高為64.7%。相比而言，本研究中3株反硝化菌均具有較好的脫氮能力，需進一步考察其在反硝化MFC中的脫氮性能。

圖2 3種菌株的反硝化性能Fig.2 Nitrogen removal efficiency of three strains

2.3 反硝化MFC運行效果

2.3.1 反硝化MFC脫氮性能

圖3 反硝化MFC的脫氮性能Fig.3 Nitrogen removal efficiency of denitrification MFC

2.3.2 反硝化MFC產(chǎn)電性能

3種菌株構(gòu)建的反硝化MFC在運行前180 min的電壓變化見圖4。可以看出，M1菌株構(gòu)建的反硝化MFC起始電壓在171.6 mV，前80 min內(nèi)反硝化MFC的電壓持續(xù)快速增長，80 min后電壓仍保持平穩(wěn)上升趨勢，140 min時達到240 mV左右并趨于穩(wěn)定，相比于另外兩個反硝化MFC，M1菌株構(gòu)建的反硝化MFC電壓最高且最早達到穩(wěn)定，這也證實M1菌株在脫氮和發(fā)電上均具優(yōu)勢。

圖4 反硝化MFC的產(chǎn)電性能Fig.4 Electrogenesis capacity of denitrification MFC

M1菌株與M3菌株有較近親源性，但從構(gòu)建的反硝化MFC發(fā)電性能上看，M1菌株優(yōu)于M3菌株，可能與M1菌株自身含有的色素有關(guān)。M1菌株中的細胞色素可以進行直接的電子轉(zhuǎn)移，促進了細菌與電極之間的電子傳遞[16]。M2菌株起始電壓較高，為189.1 mV，自身產(chǎn)電性能較強，電壓在短暫的下降后呈現(xiàn)上升趨勢，在前90 min時上升較為平緩，此后上升較快，M3菌株相對于M1、M2達到峰值所用的時間更長，但趨勢較為穩(wěn)定，一直呈上升趨勢，可能因為M2、M3菌株對本實驗條件的適應(yīng)過程較長，當(dāng)菌株適應(yīng)后，電壓上升速度明顯加快。

對脫氮、產(chǎn)電性能均較好的M1菌株反硝化MFC進行全過程電壓分析，結(jié)果見圖5。80 h內(nèi)，其起始電壓為171.6 mV，3 h內(nèi)電壓快速上升后達到峰值242.0 mV并持續(xù)至16 h，隨后電壓下降，80 h后電壓降至155 mV左右。后續(xù)研究均采用M1菌株構(gòu)建的反硝化MFC進行影響因素分析。

圖5 M1菌株反硝化MFC的電壓變化Fig.5 Voltage variation of strain M1 denitrification MFC

2.4 影響因素分析

2.4.1 C/N的影響

根據(jù)實驗結(jié)果，C/N為5.0、2.0、1.0、0.5時，反硝化MFC在80 h的脫氮率分別為90.38%、92.86%、90.79%、89.96%，可見反硝化MFC在低C/N廢水中依然能保持較高的脫氮率，說明在低C/N水平下利用反硝化MFC脫氮具有較強的可行性。C/N為2.0時反硝化MFC電壓最快達到平衡，電壓最高值為331.0 mV，在此C/N下反硝化MFC系統(tǒng)的脫氮、產(chǎn)電性能都比較好。而C/N比為5.0時，雖然起始電壓(223.4 mV)比C/N為2.0時(189.0 mV)高15.4%，但隨著反應(yīng)的進行，電壓增速總體平緩，在運行約10 h開始低于C/N為2.0時的電壓，電壓最高值僅為272.2 mV，可能因為C/N過高時，較多的有機碳使產(chǎn)電菌繁殖加快，細菌之間存在競爭，氧化有機物產(chǎn)生的電子不能全部用于產(chǎn)生電流，而是被消耗用于自身新陳代謝。相比之下，C/N為2.0時，細菌數(shù)量相對較少，細菌之間競爭并不強，因此氧化有機物產(chǎn)生的電子可充分用于產(chǎn)電，電壓更高。

但過低的C/N同樣不利于反硝化菌產(chǎn)電。當(dāng)C/N為1.0、0.5時，電壓最高值顯著下降，只有70 mV左右。這是因為碳源供應(yīng)不足時，反硝化菌僅能維持自身新陳代謝，盡管對反硝化過程無明顯影響，但能夠用于產(chǎn)電的自由電子數(shù)量大大下降，因而產(chǎn)電受到顯著抑制。

綜上可知，反硝化MFC系統(tǒng)適宜的C/N為2.0，該數(shù)值較接近我國地表水中實際的C/N水平(2.59左右)[17]，因而具有較強的實際應(yīng)用潛能。

2.4.2 pH的影響

不同pH下，反硝化MFC的脫氮、產(chǎn)電性能見圖6。由圖6(a)可見，pH為8.5、9.0、9.5時，反硝化MFC在96 h的TN分別為33.82、19.25、23.06 mg/L，脫氮率分別為91.55%、95.19%、94.24%，尤其是pH=9.0時，30 h時TN就降至50.35 mg/L，脫氮率達到了87.41%；而pH=7.5、10.5時，反硝化MFC脫氮能力相對較弱，96 h時TN分別降至46.22、41.54 mg/L，脫氮率僅為88.45%、89.62%。可以看出，pH為8.5～9.5時反硝化MFC的脫氮性能最佳。

圖6 不同pH下反硝化MFC的脫氮、產(chǎn)電性能Fig.6 Nitrogen removal efficiency and electrogenesis capacity of denitrification MFC under different pH

圖6(b)可見，不同pH下反硝化MFC的電壓均在24 h內(nèi)增長迅速，24 h后呈現(xiàn)不同程度的下降。在pH=9.5時，其最大電壓為344.4 mV，而在pH為7.5、8.5、9.0、10.5時反硝化MFC最大電壓分別為225.2、288.1、309.9、295.2 mV。在pH為8.5～9.5的弱堿性區(qū)間內(nèi)，反硝化MFC的產(chǎn)電能力處于較高水平。該現(xiàn)象與前人研究報道基本一致，趙芷玲[18]發(fā)現(xiàn)pH在8～9時反硝化MFC的產(chǎn)電和脫氮性能較好，比pH為7時的硝酸鹽降解率高108.5%。這可能是因為弱堿性條件消耗了一部分氫離子，使部分電子從脫氮或新陳代謝中脫離出來并能夠用于產(chǎn)電。然而當(dāng)pH過高時，不利于反硝化細菌的生長，反硝化細菌的酶活性降低，反硝化效率下降，產(chǎn)電能力降低。

3 結(jié) 論

(1) 好氧反硝化菌M1、M2、M3菌株均屬假單胞菌屬(Pseudomonas)，M1、M3菌株為橄欖綠假單胞菌潤滑亞種(Pseudomonasoleovoranssubsp. lubricantis)；M2菌株為門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)。在低碳源反硝化培養(yǎng)液中培養(yǎng)M1、M2、M3菌株，48 h的脫氮率分別為81.27%、76.66%、82.89%。

(2) 以菌株M1、M2、M3構(gòu)建的反硝化MFC在80 h時對TN為250 mg/L模擬廢水的脫氮率分別為93.75%、88.94%、91.36%。其中M1菌株構(gòu)建的反硝化MFC電壓最高且最早達到穩(wěn)定。可見M1菌株反硝化MFC在脫氮和產(chǎn)電上均具優(yōu)勢。反硝化MFC系統(tǒng)適宜的C/N為2.0，最適pH為8.5～9.5。