基于單巰基β-環糊精修飾的納米金比色法檢測水中的芘*

向 霄 鄭博文 李佳男 聶宏宇 邢海波 黃波濤#

(1.上海市環境科學研究院，上海 200233；2.上海應用技術大學化學與環境工程學院，上海 201418)

隨著煤、石油在工業生產、交通運輸以及日常生活中的廣泛應用，不斷產生的多環芳烴(PAHs)嚴重威脅著人類健康[1]。PAHs是一類含有兩個或兩個以上苯環的芳烴化合物，包括蒽、芘、苯并芘等[2]，已被列為典型的持久性有機污染物，其中大多數都為致癌物和致畸物[3-4]。在PAHs污染危險日益嚴重的情況下，對環境中PAHs進行及時、準確測定有助于環境的修復與保護，使公民免受污染的威脅。

目前對PAHs的檢測方法有質譜、色譜分析法[5-7]，酶聯免疫吸附法[8]，表面增強拉曼光譜法[9]等，上述方法雖然成熟穩定，但基本都需要大型儀器，檢測耗時較長。因此，開展環境中PAHs快速篩查，建立高效、快速、簡單的檢測方法，對保護環境、保護公民健康具有重要的理論意義和實用價值。

納米金(AuNPs)因其獨特的光學性質備受廣大研究者的青睞，其水溶液的具體顏色與金粒子間的間隔有關，當金粒子發生團聚，粒子間的間距變小時，水溶液會由紅色變為藍紫色。目前，利用AuNPs比色法開發的生物傳感器一般是利用未經修飾的AuNPs溶液，在強電解質的直接作用下，使AuNPs表面電荷發生變化，產生聚集，從而引起顏色變化；也有的是用適配體等功能性基團通過共價作用修飾到AuNPs表面，當修飾在表面的功能基團和待測物特異性結合時，會改變AuNPs顆粒之間的距離，從而引起AuNPs聚集并產生肉眼可見的顏色變化。利用這種性質可以設計出多種檢測探針，例如使用氨基酸修飾AuNPs檢測卡那霉素[10]，利用核酸適配體修飾AuNPs檢測三聚氰胺[11]等。

β-環糊精作為大分子物質，擁有一個空腔結構，對一些大小適中的分子具有識別作用，因此成為近些年的研究熱點[12-15]。通過修飾β-環糊精外沿可以使其與納米粒子結合，用來檢測PAHs[16-18]。

本研究基于單巰基β-環糊精(以下簡稱β-環糊精)、AuNPs、四甲基聯苯胺(TMB)、H2O2設計出了一種新型快速傳感器，用來檢測水中的代表性PAHs之一——芘。將AuNPs與β-環糊精結合，β-環糊精對PAHs具有分子識別作用，會使PAHs嵌入其疏水空腔中[19-21]。當體系中存在TMB/H2O2時，會拉近β-環糊精腔體間的距離從而使AuNPs發生聚集。通過肉眼可觀察到體系顏色的變化，能達到定性檢測水中芘的目的。之后可以進一步借助紫外—可見分光光度計檢測吸光度，從而實現對水中芘的定量分析。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

實驗所使用的主要儀器如下：臺式離心機(TD5M-WS)；恒溫振蕩器(THZ-98C)；pH計(PB-10)；電子天平(BSA224S)；超聲波清洗器(KS-7200E)；紫外—可見分光光度計(UV-3500)。

1.2 試 劑

β-環糊精、TMB、KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2、檸檬酸三鈉、四氯金酸、H2O2均為分析純。所有試劑和緩沖溶液均用超純水(電阻率18 MΩ·cm)配置，實驗中所用實際水樣來自海灣旅游區相關河道。

1.3 β-環糊精修飾AuNPs的制備

AuNPs的制備：燒杯中加入98 mL超純水和1 mL四氯金酸(質量分數1%)加熱攪拌至微沸再加1 mL檸檬酸三鈉(質量分數1%)，溶液顏色變為紫紅色后繼續加熱10 min，停止加熱并冷卻至室溫保存。

β-環糊精修飾AuNPs的制備過程參考文獻[11]，將制備好的AuNPs和β-環糊精(1 μmol/L)以體積比1∶1混合攪拌12 h后保存。

1.4 吸收曲線

配置7組混合液，在400～800 nm波長下掃描，繪制吸收曲線，并記錄下溶液顏色的變化。7組混合液均以AuNPs為基質，再添加下列系列混合液。混合液1為0.5 μmol/L β-環糊精、0.8 mol/L H2O2；混合液2為0.5 μmol/L β-環糊精、0.3 μmol/L TMB；混合液3為0.5 μmol/L β-環糊精、0.8 mol/L H2O2、0.3 μmol/L TMB；混合液4為0.5 μmol/L β-環糊精、0.8 mol/L H2O2、50 μmol/L芘；混合液5為0.5 μmol/L β-環糊精、0.3 μmol/L TMB、50 μmol/L芘；混合液6為0.5 μmol/L β-環糊精、0.8mol/L H2O2、0.3 μmol/L TMB、50 μmol/L芘；混合液7為0.5 μmol/L β-環糊精、50 μmol/L芘。

1.5 β-環糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描

將上述7組樣品送往上海交通大學分析測試中心進行透射電鏡(Tecnai G2 Spirit BioTWIN)掃描，進一步完成檢測體系的表征。

1.6 檢測體系的優化實驗

分別設定β-環糊精梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L，TMB梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，H2O2梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L，以優化檢測體系。除實驗變量外，固定β-環糊精為0.5 μmol/L，TMB為0.5 μmmol/L，H2O2為1.0 mol/L，芘為50 μmol/L，反應時間為10 min，反應結束后測定680 nm處吸光度。

1.7 反應時間的優化實驗

為研究反應時間對β-環糊精/AuNPs、TMB/H2O2和芘之間相互作用的影響，選擇了0、20、100 μmol/L的芘與檢測體系混合，反應時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min后測定680 nm處吸光度。

1.8 水中常見離子的影響實驗

為了研究水中常見的金屬離子對檢測體系的影響，在待測溶液中分別加入摩爾濃度為1 mmol/L的CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl，并設定芘為100 μmol/L，反應10 min，測定680 nm處吸光度。

1.9 檢測方法靈敏度實驗

配置一系列已知摩爾濃度的芘標準溶液，其中芘分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L，反應10 min后，測定680 nm處吸光度，以摩爾濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.10 實際水樣的加標回收率實驗及與傳統方法的比較

在實際水樣中分別添加10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L芘，采用此檢測方法和氣相色譜—質譜(GC/MS)分別測定其加標回收率，進行比較。

2 結果與討論

2.1 β-環糊精修飾的AuNPs檢測水中芘的原理

AuNPs溶液的顏色反映了其顆粒的聚集狀況，這種聚集一般是受溶液中電解質的影響[22]。分散態的AuNPs顆粒表面會發生等離子體共振，從而在520 nm處有最大吸收峰，此時溶液呈紅色。而AuNPs顆粒呈聚集狀態時，粒徑較大，AuNPs粒子之間的表面等離子體共振作用降低了電子激發所需要的能量，從而使AuNPs溶液的最大吸收波長發生移動，體系顏色變為藍色[23]。

鑒于此，實驗從修飾AuNPs開始，將β-環糊精連接到AuNPs表面。如圖1所示，β-環糊精二級空間結構呈現碗狀，內部有一個較大的空腔，體系中的芘可以嵌入到空腔中，形成穩定的復合結構。AuNPs首先與β-環糊精結合；由于β-環糊精對芘的分子識別作用，芘嵌入其疏水空腔中；當體系中存在TMB/H2O2時，會拉近β-環糊精腔體間的距離從而使AuNPs發生聚集，體系顏色由紅色變為藍色。

圖1 β-環糊精修飾的AuNPs檢測水中芘的原理示意圖Fig.1 Schematic description for pyrene detection by the β-cyclodextrin modified AuNPs

2.2 檢測體系的吸收曲線

首先對顯色情況進行了研究，結果見圖2。實驗結果顯示，用β-環糊精修飾AuNPs的基礎上，無論β-環糊精單獨與H2O2、TMB共存，還是催化TMB/H2O2的反應(混合液1～3)，都沒有明顯的顯色反應，溶液還是呈現出β-環糊精修飾的AuNPs的混合液4～6分別在混合液1～3的基礎上加入了芘。混合液6顏色發生明顯變化，長波區域的吸光度增加，AuNPs顆粒產生了一定程度的聚集。混合液7作為對照實驗，在體系中沒有H2O2和TMB，只有芘存在的情況下，顏色也沒有發生明顯的變化。因此，可以通過使用加入了H2O2、TMB和β-環糊精修飾的AuNPs來達到檢測水溶液中芘的目的。

圖2 檢測體系的吸收曲線Fig.2 Absorption curve of detection system

本來顏色。可能是因為β-環糊精修飾的AuNPs失去了原本的催化活性，無法正常催化TMB/H2O2的顯色反應。

2.3 β-環糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描結果

通過透射電鏡對不同樣品進行掃描，掃描結果見圖3。

圖3 不同處理下β-環糊精修飾的AuNPs的透射電鏡掃描圖Fig.3 Transmission electron microscope images of different β-cyclodextrin-modified AuNPs

當溶液中不含有芘時，β-環糊精修飾的AuNPs是規則的球形，并均勻分布在溶液中，H2O2和TMB的存在并沒有影響β-環糊精修飾的AuNPs形態。

混合液4～7中有芘的加入，也沒有使得體系中β-環糊精修飾的AuNPs發生明顯的變化。連在AuNPs表面的β-環糊精中可能已經嵌入了芘，但是β-環糊精修飾的AuNPs之間沒有發現有明顯的相互作用。

當檢測體系中H2O2和TMB同時存在時，芘的加入使得β-環糊精修飾的AuNPs發生了明顯的聚集現象。進一步證明當體系中存在TMB/H2O2時，會拉近β-環糊精腔體間的距離使AuNPs發生聚集，從而使溶液的顏色也由紅色變為藍色。

2.4 β-環糊精濃度的優化結果

檢測體系中β-環糊精的濃度影響著傳感器的穩定性。β-環糊精通過巰基連在AuNPs的表面，其濃度對靈敏度有著較大影響，因此需要對β-環糊精的濃度進行優化。由圖4可以看出，在β-環糊精為0.5 μmol/L時，檢測體系的吸光度最大，而過量的β-環糊精可能會對AuNPs正常的聚合產生阻礙作用，所以選擇0.5 μmol/L為β-環糊精最適摩爾濃度。

圖4 β-環糊精對檢測體系的影響Fig.4 Effect of β-cyclodextrin on detection system

2.5 TMB濃度的優化結果

TMB作為一種顯色劑，會在強氧化劑的作用下發生顏色的變化。檢測體系中H2O2的存在可能會引起TMB顏色的變化，從而影響整個檢測體系顏色的變化。正是因為體系中TMB的濃度對反應最終顏色有較大影響，因此需要對其進行濃度優化。由圖5可以看出，TMB低于0.3 μmol/L時，吸光度呈上升趨勢；TMB超過0.3 μmol/L后，吸光度較為穩定。因此，選擇0.3 μmol/L為TMB最適摩爾濃度。

圖5 TMB對檢測體系的影響Fig.5 Effect of TMB on detection system

2.6 H2O2濃度的優化結果

檢測體系中H2O2的濃度對反應最終顏色也有較大影響，因此需要對其進行濃度優化。由圖6可以看出，H2O2為0.8 mol/L時吸光度最大，且高于0.8 mol/L后吸光度略有下降，因此選擇0.8 mol/L為H2O2最適摩爾濃度。

圖6 H2O2對檢測體系的影響Fig.6 Effect of H2O2 on detection system

2.7 反應時間的優化結果

制備好的AuNPs溶液放置過久，可能會發生沉降；且檢測體系若需要較長的反應時間，也無法滿足快速檢測的需求。所以，考察了反應時間對檢測體系的影響。

通過圖7可以發現，在反應最初的10 min，吸光度隨著時間延長增幅較大；反應時間超過10 min后，吸光度基本上不再增長且很快達到平衡。這說明在H2O2和TMB的作用下，β-環糊精空腔內嵌入芘的AuNPs已經全部產生聚集，溶液顏色也不會繼續改變。綜上所述，選擇10 min為最佳反應時間。

圖7 反應時間對檢測體系的影響Fig.7 Effect of reaction time on detection system

2.8 水中常見離子的影響

離子強度可能對AuNPs的聚集情況產生一定影響，所以考察了水中常見的金屬離子對檢測體系的影響。由圖8可以看出，在溶液中存在Ca2+、Mg2+、Na+、K+這些離子的情況下，吸光度并沒有明顯的變化。所以離子強度對該檢測體系的結果幾乎沒有影響。

圖8 常見離子對檢測體系的影響Fig.8 Effect of ions on detection system

2.9 檢測方法靈敏度

配置一系列已知濃度的芘標準溶液，所得的吸光度在低濃度和高濃度范圍內變化趨勢不太一致，所以分別繪制低濃度和高濃度芘標準曲線，結果見圖9。芘處于低濃度與高濃度時，均與吸光度呈良好的線性關系。使用分光光度計檢測的檢測限為3.4 μmol/L。

圖9 檢測方法的靈敏度Fig.9 Sensitivity of the detection method

2.10 加標回收實驗結果

由表1可見，此檢測方法的加標回收率為96%～106%，相對標準偏差絕對值小于5%。同時用GC/MS平行測定相同樣品3次，測得的加標回收率介于98%～110%。經過對比可說明該方法用于快速檢測水中芘是可行的。

表1 本檢測方法和GC/MS分別檢測水中芘

3 結 語

以水中芘作為檢測目標，將β-環糊精修飾到AuNPs表面，選取TMB、H2O2作為聚合劑，建立了一種簡單、高效、快速檢測水中芘的新方法。其原理是TMB、H2O2的存在改變了AuNPs在芘嵌入β-環糊精空腔后的距離，使得AuNPs顆粒產生聚集。隨著反應的發生，AuNPs溶液顏色由紅色變為藍色，吸收曲線和特征吸收峰的吸光度也隨之發生了改變。

此檢測體系最適條件分別為0.5 μmol/L β-環糊精、0.3 μmol/L TMB、0.8mol/L H2O2，最佳反應時間10 min。使用分光光度計檢測的檢測限為3.4 μmol/L。在實際水樣的檢測中，芘的加標回收率為96%～106%，可以滿足實際水樣中芘的精確檢測要求。