基于DNA條形碼的長江口魚類浮游生物形態分類研究

劉守海，楊旖祎，何彥龍，季曉，王宇壇，張海景，毛如意，蔣曉山，程祥圣*

( 1.國家海洋局東海環境監測中心，上海 201206；2.自然資源部海洋生態監測與修復技術重點實驗室，上海 201206；3.國家海洋局東海海洋環境調查勘察中心，上海 200137)

1 引言

魚類浮游生物（Ichthyoplankton）是魚卵、仔魚和稚魚的統一簡稱，魚卵和仔、稚魚是魚類生活史早期發育的重要階段。作為魚類種群補充的重要來源，它們的種類分布和數量變化是評估海域魚類產卵場、親魚資源量和漁業資源補充量最直接有效的數據資料之一。仔、稚魚既是生物能的消費者，又是生物能的轉換者，是海洋食物鏈中的重要環節之一，基于此，魚類浮游生物已成為海洋生物多樣性與海洋生態學的重要研究對象[1]。準確鑒定魚類浮游生物是開展這些研究的基礎。魚類發育過程的形態變化非常復雜，因此，如何系統準確地找出各發育階段的形態變化、找出最基本的特征是這一基礎的前提。通過傳統形態學方法來認識魚類早期發育變化的方法有3種[2]：第1種是人工授精法，通過對某種成魚進行人工授精獲得的樣品與天然采集到的樣品進行比較來鑒別種類[3-4]，這種方法鑒定的種類是絕對可靠的，但往往受海上條件所限，在海上進行現場人工授精是比較困難的；第2種方法是動態研究法，即用大量不同大小的標本，按發育期先、后進行追蹤觀察，比較形態和器官的發育差異，以形態進行分類[5-8]；第3種方法是靜態研究法，是以單個個體完整性為重點，追尋個體形態發育階段的主要特征，其優點是僅用少數標本便可進行鑒定分類，但此方法要求鑒定者非常熟悉各科、屬、種的幼體形態特征[9]。

隨著科學技術的進步，魚類浮游生物鑒定工作的準確性得到很大的提升，如掃描電鏡技術的發展讓研究者可以通過電子顯微鏡觀察魚卵的卵膜結構來進行種類的鑒定[10-12]。近年來，隨著DNA條形碼（DNA barcoding）技術在魚類鑒定研究中廣泛應用[13]，更多學者嘗試利用DNA條形碼對魚類浮游生物進行種類鑒定。Pegg等[14]利用COⅠ基因對澳大利亞南部大堡礁的仔魚進行了鑒定。Valdez-Moreno等[15]利用DNA條形碼對墨西哥尤卡坦半島附近海域的成魚和仔魚（早期魚類）進行種類鑒定研究。Ko等[16]應用DNA條形碼評估了5家研究機構仔魚形態鑒定結果的精確度，通過DNA條形碼鑒定到種水平的仔魚占69%。該研究認為，DNA條形碼技術是種類鑒定的最好方法之一。周美玉等[17]將從形態學特征鑒定為2種類型魚卵和3種類型仔、稚魚的樣品，應用DNA條形碼技術分析鑒定出魚卵種類為3種、仔、稚魚種類為4種。劉守海等[18]通過DNA條形碼技術鑒定調查所獲得的7目10科樣品，鑒定到種的比例高達94.7%。周曉夢等[19]應用DNA條形碼和形態對短吻紅舌鰨（Cynoglossus joyneri）魚卵、仔魚進行了鑒定。以上結果說明，DNA條形碼應用于魚卵和仔、稚魚的鑒定可大大提高種類鑒定結果的精確性，這些研究大大提高了魚類浮游生物的鑒別準確性。

長江口水域由于長江徑流帶來了大量的營養物質，孕育了豐富的餌料資源，使之成為多種經濟魚類的產卵、育幼和索餌的重要場所[20]。長江口的魚類浮游生物研究始于20世紀80年代[21-24]，長江口共有魚類浮游生物56科123種，其中鑒定到種為93種，鑒定到屬為6種，鑒定到科為17種，未定種為7種。以上調查皆通過形態獲得種類鑒定結果，且有一定比例的種類未定到種。本文以2016年5月和8月及2017年8月長江口及其鄰近海域的仔、稚魚樣品為材料，采用形態學與DNA條形碼相結合的形式進行魚類浮游生物分類研究，獲得了長江口春夏季魚類浮游生物種名錄，通過攝影、繪圖等手段，記錄并描述報道較少種類的魚類早期發育階段的形態特征，為河口魚類育幼場的研究提供了科學依據，也為魚類早期發育階段資料的積累探索了新途徑。

2 材料與方法

2.1 樣品采集和形態學鑒定

于2016年5月、8月以及2017年8月在長江口及其鄰近海域設置采樣站點（圖1），按照《海洋調查規范》（GB/T 12763.6-2007）使用淺水Ⅰ型網（網長為145 cm、網口內徑為50 cm、網口面積為0.5 m2、篩絹孔徑為0.505 mm）和大型浮游生物網（網長為280 cm、網口內徑為80 cm、網口面積為0.5 m2、篩絹孔徑為0.505 mm）在站點分別進行垂直拖網和水平拖網。采集到的標本現場進行初步處理，用無水乙醇保存。

圖1 長江口海域采樣站位圖Fig.1 Sampling stations in the Changjiang River Estuary

在室內Nikon SMZ 25體視顯微鏡（尼康，日本）下，根據魚卵和仔、稚魚形態特征，對樣品進行初步鑒定[2,25]。用NIS-Elements D軟件進行拍照并獲取體長、頭長、眼徑等參數。從形態鑒定結果中，按1～10、10～50、50～100、大于 100的數量組，分別取1個、3個、5個、10個個體進行DNA條形碼分子實驗。

2.2 DNA條形碼分析方法

魚卵取單個整粒魚卵，體長小的仔魚取整條，較大的仔、稚魚取尾部。取肌肉約100 mg，使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。使用通用引物F1：TCR ACY AAY CAY AAA GAY ATY GGC AC和 R1：TAG ACT TCW GGG TGR CCR AAG AAT CA擴增仔、稚魚的線粒體DNA 的COⅠ部分序列，PCR總反應體系為50 μL，其中包括：10×PCR 緩沖液 5 μL、dNTP 4 μL（濃度為2.5 mmol/L）、上下游引物各 2 μL（濃度為 10 mmol/L）、Taq DNA 聚合酶 0.8 μL（濃度為 5 U/μL）、模板 DNA 1 μL，加雙蒸水至總體積 50 μL。樣品在 AG-22331 型PCR儀上進行擴增，94℃預變性5 min；94℃ 變性30 s、52℃ 退火 45 s、72℃ 延伸 1 min，35 個循環；72℃ 延伸10 min；4℃保存。擴增產物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海杰李生物技術有限公司膠回收雙向測序后拼接。

2.3 數據處理

利用DNAStar 軟件包對測得的序列和GenBank下載序列進行校對，用Clustal X對所有序列進行比對排序并去除兩端冗余列。將確定有效的COⅠ基因序列在 Bold System（Barcode of Life Data System）數據庫和 GenBank中進行BLAST分析來物種鑒定。采用遺傳相似度不低于99%的為同一物種，92%～99%為同一屬，85%～92%為同一科的標準對本調查海域的魚類浮游生物進行種類鑒定[13,16]，對于比對到不同物種上的序列，進一步通過構建系統發育關系樹來確定物種。結果按照《拉漢世界魚類名典》[26]進行同種異名的校正。

3 結果與分析

3.1 2016?2017 年長江口及鄰近海域魚類浮游生物種類組成

2016年5 月、8月以及2017年8月，調查共獲得魚類浮游生物9目19科55種，其中鑒定到種的有45種，鑒定到屬的有5種，鑒定到科的有5種，鑒定到種的比例為81.8%。鱸形目種類數最多有33種，其次是鯉形目有6種，鯡形目和鰈形目含有相同種類數都為4種，鯔形目2種，鲀形目2種，鲉形目2種，鰻鱺目1種，仙女魚目1種。在鱸形目中，以蝦虎魚科和石首魚科最多，兩者占鱸形目種類的近80%（表1）。

從種類組成的季節分布來看，魚類浮游生物類群的季節變化不明顯，其中，以鯉形目的鯉科，鯡形目的鳀科，鱸形目的石首魚科和蝦虎魚科為主。但在種類上有明顯的季節變化，夏季魚類浮游生物種類數多于春季。在5月和8月均出現的種類僅有鳳鱭（Coilia mystus）、日本鳀（Engraulis japonius）和小黃魚（Larimichthys polyactis）。僅在5月出現的種類有16種，以淡水的鯉科和咸淡水的蝦虎魚科為主，包括鯉科的鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、青魚（Mylopharyngodon piceus）、鳊魚（Parabramis peknensis），蝦虎魚科的斑點竿蝦虎魚（Luciogobius guttatus）、睛尾蝌蚪蝦虎魚（Lophiogobius ocellicauda）、斑尾刺蝦虎魚（Acanthogobius ommaturus）等。僅在8月出現的種類有36種，以蝦虎魚科（14個）、石首魚科（6個）和鯉科（3個）為主。包括鯉科的寡鱗飄魚（Pseudolaubuca engraulis）、銀飄魚（Pseudolaubuca sinensis），石首魚科的棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）、皮氏叫姑魚（Johnius belangerii）、叫姑魚（Johnius grypotus）、鮸（Miichthys miiuy），蝦虎魚科的阿部氏鯔蝦虎魚（Mugilogobius abei）、髭縞蝦虎魚（Tridentiger barbatus）、孔蝦虎魚（Trypauchen vagina）、拉氏狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus lacepedii）等。

3.2 形態描述

我國已知海洋魚類已超3 000種，但資料可查的魚卵與仔、稚魚種類不超過300種[2,27]。在傳統方法研究下，一些仔、稚魚常見種或隱存種[18]，如龍頭魚（Harpadon nehereus）、前鱗龜鰉（Chelon affinis），沒有得到認識。仔、稚魚發育是連續變化的一個過程，目前有很多種類只有某個階段的形態特征描述及圖譜[28]，如四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）、少鱗鱚等。因此，本文選擇之前報道較少種類進行形態特征描述，并繪制手繪圖，獲得分類鑒定資料。

3.2.1 龍頭魚Harpadon nehereus（Hamilton 1822 ）

（1）分類地位

仙女魚目Aulopiformes，狗母魚科Synodontidae，龍頭魚屬Harpadon。

（2）參考序列

JX534239，KP112261。

（3）形態特征

全長為5.97 mm，體長為5.82 mm。卵黃囊已全部吸收。頭長為0.83 mm，占體長的14.3%，眼徑為0.29 mm，占頭長的34.9%。眼變黑，口、咽、消化道已經相通，消化道細長，自胸鰭基至肛門處的消化道背緣兩側有3對橢圓形黑色素斑塊，3對色素斑呈等間隔分布。肛門位于體中央稍后。肛前距為4.11 mm，占體長的70.6%。肛后尾部腹緣有1個菊花狀黑色素。尾端脊索平直。背部鰭膜起始于顱頂，然后向后一直延伸到尾部鰭膜，無色透明，腹部鰭膜起點略低于背部鰭膜（附圖 A1a）。

全長為 9.75 mm，體長為 9.24 mm。頭長為 1.25 mm，占體長的13.5%，眼徑為0.47 mm，占頭長的37.6%。口裂增大。胸鰭基至肛門前共有5對橢圓形黑色素斑塊，在原來第1對、第2對之間和原來第3對后面，各增加1對色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為6.84 mm，占體長的74.0%。肛后尾部腹緣有1個菊花狀黑色素。脊索向上翹。臀鰭鰭條出現，尾鰭有20～22 鰭條（附圖 A1b）。

全長為30.55 mm，體長為26.35 mm。頭長為3.94 mm，占體長的15.0%，眼徑為1.31 mm，占頭長的33.2%。肛門前共有6對橢圓形黑色素斑塊，胸鰭前增加1對黑色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為19.34 mm，占體長的73.4%。肛后尾部腹緣菊花狀黑色素消失。第一背鰭10鰭條，脂鰭出現，腹鰭鰭條形成。尾鰭基底出現4個較小斑塊狀色素（附圖A1c）。

全長為40.37 mm，體長為34.27 mm。頭長為6.73 mm，占體長的19.6%，眼徑為1.25 mm，占頭長的18.6%。兩側至肛門前共有7對黑色素斑。肛門位于體中央稍后。肛前距為25.81 mm，占體長的75.3%。第一背鰭12鰭條，脂鰭始點在臀鰭中間位置。腹鰭15鰭條。臀鰭8鰭條。尾鰭基底4個黑色素塊消失2個，僅剩2處較小斑塊狀色素（附圖A1d）。

（4）研究概況

有關龍頭魚早期生活史的研究，Delsman[29]記錄了0.8 mm的龍頭魚魚卵；沖山宗雄[9]對日本海域體長為25～30 mm的龍頭魚稚魚的形態作過描述。本文描述龍頭魚從仔魚到稚魚（體長為5.82 ～34.27 mm）的個體發育形態，補充了仔、稚魚形態特征變化的描述。

3.2.2 前鱗龜鰉Chelon affinis(Günther 1861)

（1）分類地位

鯔形目Mugiliformes，鯔科Mugilidae，龜鰉屬Chelon。

（2）參考序列

JF911709。

（3）形態特征

全長為26.54 mm，體長為21.82 mm。頭長為6.51 mm，占體長的29.8%，眼徑為2.13 mm，占頭長的32.7%。上下頜有色素，自頭后至尾柄的體側中軸以上星狀、樹枝狀和菊花狀色素不規則分布。臀鰭基部分布樹枝狀和菊花狀色素。肛門位于體中央稍后。肛前距為15.00 mm，占體長的68.7%。所有鰭條都已形成。背鰭2個，第一背鰭II鰭棘5鰭條，第二背鰭II鰭棘7鰭條。臀鰭起始位置比第二背鰭起點略靠前，臀鰭II鰭棘 12 鰭條（附圖 A2）。

（4）研究概況

沖山宗雄[9]對日本海域體長為4.1～12.0 mm的前鱗龜鰉形態作過描述。國內未見前鱗龜鰉早期生活史的研究報道。本文描述了體長為21.82 mm前鱗龜鰉稚魚的形態。

3.2.3 四 指 馬 鲅Eleutheronema tetradactylum（Shaw 1804）

（1）分類地位

鱸形目Perciformes，馬鲅科Polynemidae，四指馬鲅屬Eleutheronema。

（2）參考序列

KC878730。

（3）形態特征

全長為11.18 mm，體長為9.88 mm。體前部呈橢圓形，頭較大，頭長為3.02 mm，占體長的30.6%，眼徑為0.69 mm，占頭長的22.8%。吻鈍圓，上頜骨有左右對稱的1對黑色素。肛門位置約為體中部，肛前距為5.68 mm，占體長的57.5%。脊索尾椎骨向上彎曲。背鰭2個，第一背鰭VI鰭棘，第二背鰭I鰭棘15 鰭條。臀鰭位置與第二背鰭相對應，臀鰭II鰭棘17鰭條。腹部胸鰭下方有1個黑色素。臀鰭基有1排黑色素，始于臀鰭中部，約10個附圖（A3）。

（4）研究概況

有關四指馬鲅早期生活史的研究，多以人工培育下四指馬鲅早期發育的形態及生長的觀察為主[30-32]。王曉東[33]描述了全長為13.4 mm四指馬鲅稚魚的形態，各鰭鰭條數目基本穩定，鱗片開始出現。本文較詳細描述了體長為9.88 mm四指馬鲅稚魚的形態，發現臀鰭基有1排黑色素，始于臀鰭中部，約10個。

3.2.4 少鱗鱚Sillago japonica(Temminck et Schlegel 1843)

（1）分類地位

鱸形目Perciformes，鱚科Sillaginidae，鱚屬Sillago。

（2）參考序列

AP017438。

（3）形態特征

全長為13.89 mm，體長為12.71 mm。頭長為3.35 mm，占體長的26.4%，眼徑為1.15 mm，占頭長的34.3%。頭部眼后方有數個小塊狀黑色素，下顎、腹部正中線、臀鰭基底有點狀黑色素分布，尾柄背緣、腹緣及體側正中線有斑塊狀黑色素分布，尾鰭基底出現2叢黑色素。肛門位于體中央略前。肛前距為6.07 mm，占體長的47.8%。第一背鰭VIII鰭棘，第二背鰭19鰭條，胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭鰭條已形成（附圖A4）。

（4）研究概況

有關少鱗鱚早期生活史的研究，水戸敏[34-35]對日本福岡外海的少鱗鱚進行了人工授精、孵化實驗，詳細描述了魚卵和仔、稚魚的發育與形態；沖山宗雄[9]對體長為2.6～16.5 mm的少鱗鱚仔、稚魚的形態作過描述；王曉東[33]描述了全長為6.5～16.5 mm少鱗鱚仔稚魚的形態。本文描述了體長為12.71 mm少鱗鱚稚魚的形態，發現尾柄背緣、腹緣及體側正中線有斑塊狀黑色素分布，尾鰭基底出現2叢黑色素。

3.2.5 日 本 須 鰨Paraplagusia japonica（Temminck &Schlegel 1846）

（1）分類地位

隸屬于鰈形目Pleuronectiformes，舌鰨科Cynoglossidae，須鰨屬Paraplagusia。

（2）參考序列

JQ639066。

（3）形態特征

全長為6.08 mm，體長為5.92 mm。頭長為1.42 mm，占體長的24.0%，眼徑為0.36 mm，占頭長的25.4%。卵黃囊仍未完全消失，卵黃囊下方有一簇色素。口鈍圓，上、下頜及鰓蓋骨形成。顱頂上方棘冠出現2條長棘條，長度分別為1.13 mm和1.49 mm。體部背緣有5個叢狀黑色素，每叢5～6個樹枝狀黑色素或點狀黑色素，腹緣有1列不規則排列的黑色素分布。肛門位于體中央略前。肛前距為2.51 mm，占體長的42.4%。尾部鰭膜上出現彈性絲（附圖A5）。

（4）研究概況

有關日本須鰨早期生活史的研究，男卓志[36]報道了日本若狹灣西部及其鄰近海域直徑為0.8 mm左右的日本須鰨卵和體長為5.95～12.30 mm的日本須鰨仔、稚魚形態；丘臺生[37]描述了我國臺灣沿海體長為4.0～7.9 mm的日本須鰨仔稚魚形態；沖山宗雄[9]對體長為10.2～12.3 mm的日本須鰨仔稚魚的形態作過描述；萬瑞景和張仁齋[25]描述了1984年6月采自東海海域的體長6.80 mm的日本須鰨仔魚形態，體側背緣自頭后至尾端有10余個叢狀黑色素，體側的腹緣也有9個叢狀黑色素分布。本文描述了體長為5.92 mm日本須鰨仔魚的形態，發現體部背緣有5個叢狀黑色素，每叢5～6個樹枝狀黑色素或點狀黑色素，腹緣有1列不規則排列的黑色素分布。

4 討論

DNA條形碼技術是一項通過標準化的短基因片段的序列差異來對物種進行鑒定的技術。相對于傳統的形態分類方法，DNA條形碼技術最大的優勢在于它能準確鑒定不同發育階段的個體、形態相似度較高的物種和因缺少形態學分類數據而導致很難進行區分的個體[38]。這項技術運用到魚類浮游生物的鑒定中，快速解決了很多傳統形態學分類方法無法解決的問題[28]。物種判別標準是分子鑒定研究中最重要的因素，根據Ward等[39]、Ko等[16]、周美玉等[17]的研究結果，本文采用遺傳相似度不低于99%的為同一物種、92%～99%為同一屬、85%～92%為同一科的標準對本調查海域的魚類浮游生物進行種類判定。大多數的種類能夠準確鑒定到種（表1）。部分樣品序列因與某一物種相似度不高而未鑒定到種，如有序列與數據庫中的寡鱗飄魚相似度最大為98%，故鑒定到飄魚屬。有些樣品序列與兩個種類的相似度均為99%～100%，且這些種類在本調查區域均有出現[40-41]，故只將其鑒定到科或屬的水平。如最后鑒定為鯔蝦虎魚屬的序列，其與數據庫中的阿部氏鯔蝦虎魚和粘皮鯔蝦虎魚（Mugilogobius myxodermus）相似度為99%以上，且二者在本調查海域均有分布記錄。本研究中樣品序列與大鰭彈涂魚（Periophthalmus magnuspinnatus）和青彈涂魚（Scartelaos histophorus）相似度均為99%的序列，因此無法準確鑒定，故將其鑒定為蝦虎魚科[42]。此外，本研究鑒定的序列，與數據庫中黑鰓梅童魚（Collichthys niveatus）（HM219223）和小黃魚相似度達99%以上，根據Cheng等[43]研究可知，黑鰓梅童魚序列疑為形態鑒定有誤，故本研究將其鑒定為小黃魚。因此數據庫的完整性與可靠性對鑒定結果的準確性至關重要。

表1 長江口魚類浮游生物種名錄（2016年春季（5月）、夏季（8月）和2017年夏季（8月））Table 1 List of ichthyoplankton species of Changjiang River Estuary（spring (May),summer (August) 2016 and summer (August) 2017）

長江口魚類浮游生物在種類上有明顯的季節變化，而類群無明顯的季節變化。本研究中，僅在5月出現的種類有16種，有36種僅在8月出現。在溫帶和亞熱帶河口，魚類浮游生物的數量在夏季達到峰值，且具有優勢種種類季節變動模式[23]。本研究中，河口魚類浮游生物主要類群為蝦虎魚科和鯉科，但同一類群里種類有季節變化，如同為鯉科，5月出現的種類為鰱魚、青魚、鳊魚，8月出現的種類為寡鱗飄魚、銀飄魚。根據生態位競爭排斥原理，生態上類似的種很少能共存于一個生態位中，因而生活在一起的各個物種都必須有它們自己獨特的生態位[44]，即相同科或者相同屬魚類在時間上出現明顯的錯位分布，因為生態位接近，時間錯位分布可以減少對空間和食物資源的競爭[45]。這一現象在長江口成魚也有出現，鯧科鯧屬的銀鯧（Pampus argenteus）（出現于 5-8月）和灰鯧（Pampus cinereus）（出現于 8-9 月），尾數有明顯的時間錯位分布現象[45]。成魚的繁殖策略和產卵區域水體環境的季節變化是河口魚類浮游生物種類季節變動的主要因素之一[46-47]。

本研究采用傳統形態學和現代分子生物學方法相結合的研究思路，在DNA條形碼技術的輔助鑒定下，收集了魚類浮游生物形態特征，積累了魚類早期發育的形態分類信息[28]。本研究首次描述了隱存種[18]前鱗龜鰉稚魚、河口常見優勢種[48]龍頭魚仔稚魚階段的形態特征；報道了少鱗鱚、四指馬鲅和日本須鰨等種類在不同發育階段或不同體長的特征。這些工作完善了魚類浮游生物的分類鑒定資料，為魚類早期發育階段分類資料的積累探索了新途徑。

致謝：何日光、彭小家、陳耀輝等同志在室內樣品和數據處理等方面做了大量工作，謹致謝忱。特別感謝陳蓮芳研究員對本文審閱并提出寶貴意見。

續表1

附錄1

圖 A1 龍頭魚仔稚魚Fig.A1 Larvae and juvenile stages of Harpadon nehereus

圖 A2 前鱗龜鰉稚魚Fig.A2 Juvenile stage of Chelon affinis

圖 A3 四指馬鲅稚魚Fig.A3 Juvenile stage of Eleutheronema tetradactylum

圖 A4 少鱗鱚稚魚Fig.A4 Juvenile stage of Sillago japonica

圖 A5 日本須鰨仔魚Fig.A5 Larvae stage of Paraplagusia japonica