軍曹魚(Rachycentron canadum)性腺分化及首周年發育的組織學觀察

鄺杰華，陳剛,2*，馬騫,2*，毛非凡，周啟苓，黃建盛,2，施鋼，張健東,2

( 1.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524025；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江 524025)

1 引言

軍曹魚（Rachycentron canadum）隸屬鱸形目（Perciformes）、 軍 曹 魚 科 （Rachycentridae）、軍 曹 魚 屬（Rachycentron），為廣鹽暖水性海水魚類，俗稱海鱺、海龍魚，廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域（東太平洋除外）[1]，在南海部分海域亦有少量分布。由于軍曹魚具有生長速率快、易于馴化、抗病力強、肉厚、肉質細膩等特點[2]，近年來，其在我國南方沿海地區的養殖發展迅猛，隨著人工繁殖和大規模育苗技術的突破，已成為我國極具前景的海水網箱養殖魚類之一。

性腺發育是魚類繁殖的前提條件，對魚類種群的繁衍發展至關重要。硬骨魚類性腺發育需經歷發生、分化及成熟3個階段，原始生殖細胞（PrimordialGerm Cells，PGCs）遷移至生殖嵴后與體細胞構成性腺原基，隨著性腺原基內的PGCs和體細胞進一步分裂增殖，逐漸發育為原始性腺[3]。隨后，原始性腺分化出兩性特征，而性腺從分化結束到形成成熟精巢或卵巢的整個過程均會表現出明顯的階段性特征，絕大部分還會表現出周期性變化。目前，國內外學者[4-5]主要根據解剖學和細胞學上的特征將魚類性腺的發育劃分為不同分期。軍曹魚為多次產卵類型魚類，在外觀上缺乏性別二態性，難以通過體表特征準確判斷其雌雄。近年來，國外學者[6-7]已對部分水域野生軍曹魚種群的繁殖習性和性腺發育特征開展了相關基礎研究；許樂樂等[8]通過對性成熟軍曹魚精巢的組織學觀察，分析精巢生殖上皮的動態變化，以評估軍曹魚精巢發育狀況的周年性變化；Dhanasekar等[9]利用透射電鏡技術對軍曹魚精巢中的生精細胞進行觀察分析，首次記錄了軍曹魚精子超微結構，并詳細描述其發育過程；Dutney等[10]發現內分泌干擾化學物質的干擾可導致軍曹魚性激素分泌失衡，部分個體甚至出現雌雄同體的現象。然而，有關軍曹魚原始生殖細胞的起源、遷移和分化及配子發生等方面的研究尚未見報道。

本研究以1～360孵化日齡(days post hatching，dph)的不同發育階段軍曹魚為研究對象，采用石蠟組織切片和蘇木精-伊紅（Haematoxylin-Eosin，H.E.）染色法，系統觀察并描述了軍曹魚原始性腺的形成、分化特征及精巢和卵巢首周年發育的組織結構變化，相關結果將進一步豐富軍曹魚的繁殖生物學研究內容，有助于闡明其性腺發育規律，為海水魚的繁育生產提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料及處理

2019年4 月，在廣東省湛江市東海島養殖科技園通過人工繁殖獲得軍曹魚初孵仔魚，從海上網箱中挑選自養的3齡以上成魚作為親魚，在室外水泥池（100 m3）中強化培育，注射 LRH-A3和 HCG 催產，雌魚注射劑量分別為 LRH-A38 μg/kg，HCG 1 200 IU/kg，雄魚的注射量為雌魚的1/2，效應時間為10～12 h。孵化后的仔魚培育于室內水泥池（5 m×3.5 m×1.5 m）中，于55 dph時將其轉移至廣東省茂名市電白縣某室內養殖基地，飼養于直徑為9 m，水深為2.5 m的金屬圓形水池內，流水充氣，養殖鹽度為27.0～30.5，溫度為25.0～30.0℃。

實驗用魚均經40 mg/L的丁香酚麻醉，測量形態學指標后進行取樣。（1）1～15 dph（5～35 mm）：整體取樣，每 2 d取 1次樣，每次取樣 20尾；（2）16～52 dph（40～150 mm）：對于性腺未形成的稚魚直接剪取腹部性腺所在位置，對于性腺已成形的稚幼魚則解剖取出性腺，每 3～4 d取 1 次樣，每次取樣 20尾；（3）60～360 dph（21.8～68.5 cm）：分別對60 dph、90 dph、120 dph、150 dph、185 dph、210 dph和360 dph體質良好的軍曹魚進行取樣，解剖后迅速取出性腺，其中，實驗用雌魚共 26尾，體重為 165.0～5 050.0 g，體長為 22.4～68.5 cm；雄魚共21尾，體重為160.0～4 225.0 g，體長為21.8～64.5 cm。采集的所有樣品均經4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）固定24 h，隨后轉至70%乙醇中保存。

2.2 實驗方法

將已固定好的組織樣品經過50%、70%、80%、95%（第1次脫水）、95%（第2次脫水）、100%（第1次脫水）及100%（第2次脫水）乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透和包埋。用Leica RM2125手動輪轉式切片機進行連續切片，切片厚度為 5～6 μm，采用蘇木精-伊紅染色，最后用中性樹膠封片保存，通過Nikon E80i顯微鏡進行觀察，并采集顯微圖像。參照劉筠[11]對魚類性腺分期的方法，對不同日齡軍曹魚精巢和卵巢進行發育分期的劃分。

3 結果

3.1 原始生殖細胞的特征變化及遷移

3 dph（平均全長為4.5 mm），在魚體腹部后方靠近生殖孔的位置，可觀察到游離的單個原始生殖細胞分布于腸管上方與中腎管側下方之間的空腔（圖1a）。原始生殖細胞呈橢圓形，其直徑（7～8 μm）明顯大于周圍的體細胞，細胞核（3～4 μm）占比大且邊界明顯，著色較淺，核仁清晰（圖1b）。5 dph（平均全長為6.1 mm），原始生殖細胞沿著腹腔背側的腸系膜遷移至中腎管的正下方，呈梨形，直徑增大（圖1c）。7 dph（平均全長為8.2 mm）和9 dph（平均全長為10.1 mm），原始生殖細胞均遷移到達貼近腎臟下方的位置，即生殖嵴處，細胞形態無明顯變化，仍為單個游離狀態（圖1d，圖1e）。11 dph（平均全長為 12.3 mm），腹膜上皮組織的體細胞開始聚集于生殖嵴處原始生殖細胞的周圍（圖1f）。15 dph（平均全長為 23.7 mm），原始生殖細胞已被數層體細胞包圍，在生殖嵴處形成兩個朝向體腔的芽狀突起，即原始性腺的雛形，標志著原始生殖細胞胚后遷移的結束（圖1g）。

圖1 軍曹魚原始生殖細胞的胚后遷移Fig.1 Migration of primordial germ cells of Rachycentron canadum during early development

3.2 原始性腺的分化

18 dph（平均全長為31.5 mm），體細胞與生殖細胞通過有絲分裂不斷增殖，體細胞的分裂速度相對更快，生殖細胞被多層體細胞完全包繞，原始性腺的橫切面呈瘤狀，并分布有血細胞（圖2a）。21 dph（平均全長為 37.5 mm）和 24 dph（平均全長為 53.0 mm），原始性腺逐漸延長，體積不斷增大，兩側性腺的一端與腹腔系膜相連，而另一端則游離于腹腔背側，每側性腺的橫切面呈細長的棒狀，面積約為 80 μm×15 μm（圖2b，圖2c）。27 dph（平均全長為 68.2 mm）和 30 dph（平均全長為79.3 mm），原始性腺的橫切面進一步增大，中部逐漸變寬而兩端較窄，生殖細胞分裂加快，數量顯著增加，但并未出現明顯的性腺分化特征（圖2d，圖2e）。

34 dph（平均全長為 90.6 mm），原始性腺開始出現分化，可觀察到部分性腺組織中排列著被體細胞包繞呈簇狀發育的生殖細胞群，部分生殖細胞的直徑為5 μm左右，呈卵圓形，胞質較少，細胞核占比大，已顯現出卵原細胞的形態學特征，預示將向卵巢方向分化（圖2f）；仍有部分個體的原始性腺尚未出現分化特征，其橫切面相對較為狹長，生殖細胞數量較少，且在性腺靠近系膜的一端形成微血管，通過對比，推測為未發生分化的精巢（圖2g）。

40 dph（平均全長為 107.9 mm），在推定的精巢組織中，生殖細胞經有絲分裂大量增殖并聚集形成精原細胞群（圖2h）。44 dph（平均全長為 118.4 mm），卵巢中的生殖細胞已基本分化為卵原細胞，血管發達，血細胞數量較多且散布于整個性腺組織內，部分體細胞聚集于性腺組織的中央區域，形成一條著色較深的細胞帶；隨后這些聚集的性腺體細胞向兩側擴張遠離，在原來細胞帶的位置產生一條狹窄的裂隙，即為卵巢腔的雛形，標志著卵巢解剖學上分化的開始（圖2j）。48 dph（平均全長為 131.4 mm）和 52 dph（平均全長為147.7 mm），精巢組織內的體細胞和精原細胞進一步分裂，橫切面明顯增大并散布有少量血細胞，精原細胞集中分布于精巢的腹側邊緣，被一層基底膜所包被形成囊狀的精原細胞團，細胞團之間由小裂縫隔開，為精母細胞囊的形成做準備，表明精巢已開始細胞學上的分化（圖2i）；卵巢組織中的裂隙不斷向兩側延伸和擴大，最終形成明顯的卵巢腔，卵原細胞通過分裂和聚集形成生殖細胞囊，細胞直徑也增大至15～20 μm，逐漸向初級卵母細胞過渡，嗜堿性較弱，被染成淺紫色（圖2k，圖2l）。

圖2 軍曹魚原始性腺的分化Fig.2 Differentiation of primary gonad of Rachycentron canadum

3.3 精巢的首周年發育特征

根據精巢中生殖細胞的種類、成熟度、數量占比及排列方式，可將60～360 dph軍曹魚的精巢樣品分為5個發育分期，分別為精原細胞增殖期（I期）、精母細胞生長期（II期）、精母細胞成熟期（III期）、精子細胞變態期（IV期）、精子成熟期（V期），尚未發現精子退化吸收期（VI期），各發育期精巢特征如下。

60 dph（體長為（22.6±1.4）cm），精巢發育至 I期，呈細線狀，橫切面積較小，精原細胞的數量較多，聚集于囊泡狀的結構內，分布于精巢的中部及腹側，同時也可觀察到少量由精原細胞轉化而成的初級精母細胞和次級精母細胞（圖3A，圖3a）。

90 dph（體長為（30.1±1.6）cm），精巢發育已進入II期，生殖細胞的數量較少，結締組織及體細胞占整個精巢組織的絕大部分。精巢中已形成零星的精小葉，精小葉內可觀察到精原細胞、初級精母細胞以及次級精母細胞（圖3B，圖3b）。

120 dph（體長為（36.8±1.4）cm），精巢發育由 II期向III期過渡，精小葉數量增多，集中分布于精巢的外緣。精小葉中形成精小囊，精小囊內以初級精母細胞和次級精母細胞為主，同時也出現了少量的精細胞（圖3C，圖3c）。

150 dph（體長為（40.3±2.0）cm），精巢發育進入III期，精小葉數量進一步增多，隨著精母細胞的成熟分裂，精小囊逐漸向精小葉腔擴展。當精細胞成熟后，精小囊破裂，將其釋放至精小葉腔中，因此在精小葉內可見大量的初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞以及少量的精原細胞（圖3D，圖3d）。

185 dph（體 長 為 （46.5±0.4）cm），精 巢 仍 處 于III期，精小葉散布于整個精巢組織中，精小囊內初級精母細胞、次級精母細胞成堆出現，精小葉腔中精細胞的數量明顯增多（圖3E，圖3e）。

210 dph（體長為（49.5±1.2）cm），精巢已發育至IV期，精小葉的體積增大，形狀逐漸變得狹長，位于精巢邊緣的精小囊體積較大，以次級精母細胞為主，而精巢內部的精小囊則基本破裂，精小葉腔中充斥精細胞，小部分精細胞已開始變態為精子（圖3F，圖3f）。

360 dph（體長為（63.4±1.3）cm），精巢處于 V 期，精小葉進一步擴大變得更為狹長，從精巢中央向邊緣呈輻射狀分布，精小囊分布于精小葉間的交界處，仍有少量的精母細胞，大部分精細胞已變態為精子，可觀察到密集的精細胞與成熟精子充滿整個精小葉腔（圖3G，圖3g）。

圖3 軍曹魚精巢首周年發育的組織學變化Fig.3 The histologic changes of first annual testicular development of Rachycentron canadum

3.4 卵巢的首周年發育特征

根據卵母細胞的發育特征及成熟度，可將60～360 dph軍曹魚的卵巢樣品劃分為卵原細胞增殖期（I期）、初級卵母細胞小生長期（II期）和初級卵母細胞大生長期（III期），卵巢尚未發育至成熟期，各發育期卵巢特征如下。

60 dph（體長為（23.2±1.7）cm），卵巢發育至 I期早期，卵巢腔占據整個卵巢的絕大部分，卵巢的橫切面呈環形，內緣呈褶皺狀，部分凸起向卵巢腔中央延伸形成產卵板，產卵板內以卵原細胞為主，細胞質含量較少，具有明顯的細胞核，個別卵原細胞已向初級卵母細胞過渡，分裂為第I時相卵母細胞（圖4A，圖4a）。

90 dph（體長為（31.5±1.7）cm），卵巢仍處于 I期，具有明顯的卵巢腔，產卵板較短，以卵原細胞及其分裂分化而成的第I期時相卵母細胞為主，細胞核占比較大，核內染色質呈絲狀并組成稀疏的網狀結構（圖4B，圖4b）。

120 dph（體長為（37.1±2.0）cm），卵巢發育由 I期向II期過渡，產卵板逐漸延長，大部分為第Ⅱ時相卵母細胞，細胞直徑明顯增大，呈橢圓形或不規則形，細胞質呈強嗜堿性，被染成紫藍色，卵母細胞間的間隔較寬，在產卵板的邊緣仍可觀察到少量卵原細胞和第I時相卵母細胞（圖4C，圖4c）。

150 dph（體長為（42.9±1.5）cm），卵巢發育進入II期，卵母細胞基本進入第II時相，在大部分卵母細胞的細胞質中可觀察到一個被染成深紫色的團塊狀卵黃核，這是早期階段第II時相卵母細胞的特征（圖4D，圖4d）。

185 dph（體長為（47.7±1.6）cm），卵巢處于 II期，產卵板內的卵母細胞排列更為緊密，細胞核與細胞質相應增大，部分直徑較大的卵母細胞中核仁的數量增加至2～3個，細胞質內出現數顆大小不一的油滴（圖4E，圖4e）。

210 dph（體 長為 （52.6±0.9）cm），卵 巢 仍 處 于II期，卵母細胞的核仁直徑明顯增大，并繼續分裂出多個較小的核仁，嗜堿性減弱，被染成淺紫色，而細胞質中的油滴數量進一步增多（圖4F，圖4f）。

360 dph（體長為（67.17±1.3）cm），卵巢發育進入III期，以早期第III時相卵母細胞為主，細胞直徑增大至100～150 μm，核仁分布于核膜內緣，油滴數量較多呈環帶狀分布，并向細胞質外緣逐漸擴展，質膜外已開始形成兩層濾泡膜，仍有少數卵母細胞處于第II時相（圖4G，圖4g）。

圖4 軍曹魚卵巢首周年發育的組織學變化Fig.4 The histologic changes of first annual ovarian development of Rachycentron canadum

4 討論

4.1 軍曹魚原始生殖細胞的遷移及性腺的分化特征

本研究通過連續的組織學觀察，詳細記錄了軍曹魚原始生殖細胞的形態特征變化、遷移方式，原始性腺的形成及分化規律。軍曹魚原始生殖細胞在遷移過程中保持單個游離的狀態且未發生有絲分裂，與大多數已報道硬骨魚類中的研究結果相同，如革胡子鯰（Clarias gariepinus）[12]、 大 菱 鲆 （Scophthalmus maximus）[13]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[14]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[15]等。軍曹魚原始生殖細胞遷移至生殖嵴后被體細胞完全包繞，于15 dph時形成芽狀的原始性腺，相似地，大黃魚（Larimichthys crocea）原始性腺的形成時間為 16 dph[16]；大菱鲆[13]和牙鲆[14]分別在 20 dph 和 22 dph 時形成原始性腺，而稀有鯽（Gobiocypris rarus）[17]的原始性腺則形成于 9 dph，表明硬骨魚類原始性腺在形成時間上存在明顯的種間差異。原始性腺發育早期體細胞有絲分裂速度加快，而生殖細胞的有絲分裂進程在后期才明顯加快。Yang等[14]在牙鲆中也發現了相似的現象，據此推測，在胚后遷移及原始性腺早期發育階段，生殖細胞可能處于分裂受阻的狀態。在34 dph軍曹魚稚魚中可發現兩類存在明顯特征差異的性腺，第1類性腺橫切面呈水滴形，生殖細胞數量較多，推測其將發育為卵巢，第2類性腺的橫切面較狹長，生殖細胞數量也較少，則推定為分化前的精巢；同樣地，在大菱鲆[13]、青鳉（Oryzias latipes）[18]、三刺魚（Gasterosteus aculeatus）[19]和藍鰓太陽魚（Lepomis macrochirus）[20]性腺分化的研究中，推定的卵巢組織中生殖細胞數量均顯著高于精巢。隨后，軍曹魚的第1類性腺在44 dph時形成卵巢腔，標志著卵巢分化開始。由此可見，原始性腺中生殖細胞數量的差異可作為判定軍曹魚性腺分化方向的標準之一。50 dph時，推定的精巢中精原細胞聚集于性腺腹側，并由基底膜包被形成精原細胞囊，預示著精巢分化的開始[21]，但此時尚未見輸精管和精小葉等精巢分化的主要標志出現。上述結果表明，軍曹魚的性腺分化屬于分化型雌雄異體型，且卵巢的分化時間要早于精巢。

4.2 軍曹魚性腺發育的首周年變化

360 dph軍曹魚精巢可發育至V期，而卵巢只發育至III期早期，由此推測雄魚的性成熟年齡約為1齡，而此時雌魚尚未達到性成熟。據報道，自然海區及網箱養殖軍曹魚的最小性成熟生物學年齡分別為：雄性1齡，雌性1.5～2齡[22-24]，由此可見，室內水池養殖條件下，軍曹魚性腺發育規律與野生及網箱養殖環境下無明顯差異。

通過對軍曹魚精巢的組織學觀察發現，精小葉的內緣排列著不規則的精小囊，同一精小囊內的生精細胞發育程度一致，當精小囊內的生精細胞成熟后，囊膜便破裂，將精子釋放至精小葉腔中并最終匯集于輸精管，這與大部分硬骨魚類如四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）[25]、黃斑籃子魚（Siganus oramin）[26]、金錢魚（Scatophagus argus）[27]、松江鱸（Trachidermus fasciatus）[28]等的生精特點相一致。軍曹魚的精子形成過程與其他硬骨魚類相同，生殖細胞由最初的精原細胞經轉化后形成初級精母細胞，隨后通過減數第1次分裂形成次級精母細胞，再經進一步的分裂產生精細胞，最后精細胞經變態形成成熟精子[29]。精巢成熟后精小葉的形狀狹長且從精巢的中央向邊緣呈輻射狀分布，根據此結構特征及生精細胞的發育特點可將其歸類為小葉型結構中的輻射型精巢，如鲇形目與鱸形目中大多數種類的精巢均屬此類型[30]。

依據不同日齡軍曹魚卵巢的組織學特征可知，I期卵巢主要包含卵原細胞及向初級卵母細胞過渡的第I時相卵細胞，細胞體積相對較小，核內染色質呈明顯的細絲狀。目前，關于第I時相卵細胞的定義尚未趨于統一，部分學者將其歸類至卵原細胞[31-32]，還有部分學者將其歸類為卵母細胞[27,33]，基于細胞特征及有絲分裂的程度，本文將其定義為第I時相卵母細胞。軍曹魚II期卵巢中含有第I時相、第II時相卵母細胞，而III期卵巢中含有第I時相、第II時相、第III時相卵母細胞，卵巢內卵母細胞的發育并不同步，這與黃斑籃子魚[26]、紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）[31]、半滑舌鰨（Oplegnathus punctatus）[32]等魚類似，由此可判定軍曹魚屬于分批同步產卵型魚類，一年可多次產卵。當卵母細胞發育至第II時相中期時，細胞質內開始形成油滴，隨著進一步的發育，油滴的數量不斷增多并呈環帶狀分布于細胞核周緣，與銀鯧（Pampus argenteus）[34]、灰鯧（Pampus cinereus）[35]和許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[36]的研究結果相一致，而金錢魚（Scatophagus argus）[27]、黑鱾（Girella leonina）[37]和美洲鰣魚（Alosa sapidissima）[38]中則發現卵母細胞發育至第III時相才開始形成油滴，由此推測，軍曹魚卵母細胞對脂質的積累能力相對較強。