肌酸化學交換飽和轉移加權成像評估大鼠膠質瘤模型肌酸濃度變化

唐湘雍，張玉忠，陳彥孜，丁 玲，沈苑玉，吳仁華*

(1.龍華區人民醫院醫學影像科，廣東 深圳 518109；2.汕頭大學醫學院第二附屬醫院醫學影像科，廣東 汕頭 515041)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤[1]，影像學檢查為主要診斷方法。傳統MRI雖能準確顯示腫瘤形態學特點及血供情況，但不能從分子層面評估病灶。磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy, MRS)能檢測組織的分子成分，直觀顯示全腦分子變化水平，其缺點是組織分辨率低?；瘜W交換飽和轉移(chemical exchange saturation transfer, CEST)成像是由磁化傳遞技術發展而來的MR分子成像新方法，能從分子水平探測組織中特定物質濃度的變化并進行成像，獲得空間圖譜[2]，已用于腦腫瘤、腦梗死及癲癇等相關研究[3]。既往研究[4-7]表明，針對多數MRS能檢出的代謝物可實現CEST成像，主要包括谷氨酸[4]、肌醇[5]和肌酸(creatine, Cr)[6-7]等。Cr是人體組織能量代謝過程中的重要物質[8]，目前已有學者[6-9]采用Cr-CEST成像研究心臟、肌肉及顱腦相關疾病。腦膠質瘤腫瘤區域細胞繁殖迅速，使能量代謝發生變化，導致Cr濃度改變。本研究觀察Cr-CEST成像評估大鼠膠質瘤Cr濃度的價值。

1 材料與方法

1.1 體外實驗 于直徑8 mm試管中配置濃度為10 mmol/L的pH 7.0 Cr溶液，以濃度1%瓊脂糖溶液固定，獲得單一Cr試管；另于5支相同試管中分別配置濃度20、40、60、80、100 mmol/L，pH均為7.0的Cr溶液，并以相同方法固定于容器中，獲得混合Cr試管；行MR掃描。

1.2 體內實驗 選取8只6周齡雄性SD大鼠(購于廣東省實驗動物中心)，體質量200～250 g，中位數231.5 g。將10 μl對數生長期C6膠質瘤細胞(濃度為106個/10 μl)接種于大鼠右側基底節區，制作大鼠膠質瘤模型。于造模后第2～3周采集大鼠頭部MRI。本研究經汕頭大學醫學院實驗動物倫理委員會批準(批準號：SUMC2013-039)。

1.3 儀器與方法

1.3.1 體外實驗 采用安捷倫7.0 T動物MR儀(美國安捷倫科技有限公司)，配備雙通道正交體線圈，行T2W、連續波點分辨波譜序列及連續波平面回波序列掃描。T2W參數：TR 2 500 ms，TE 80 ms，層厚2 mm。參考文獻[10-11]方法設置連續波點分辨波譜序列及連續波平面回波成像序列掃描參數，以連續波點分辨波譜序列掃描單一Cr試管時，TR 6 000 ms，TE 26.51 ms，預飽和能量(B1)為0.5、1.0、3.0、5.0 μT，射頻脈沖持續時間為4 s，體素3 mm×3 mm×3 mm，飽和偏移頻率為+5～-5 ppm，間隔0.25 ppm；掃描混合Cr試管時，B1為1.0 μT，余同上。以連續波平面回波成像序列掃描混合Cr試管時，翻轉角90°,TR 6 000 ms，TE 26.51 ms，矩陣64×64，層厚2 mm，FOV 40 mm×40 mm，采集次數2，B1 0.5、1.5、2.5 μT，射頻脈沖持續時間為4 s，飽和偏移頻率2.0、-2.0、300 ppm。

1.3.2 體內實驗 連續波點分辨波譜序列參數：根據T2WI所見，于腫瘤區域避開出血及壞死區設置ROI，體素3 mm×3 mm×3 mm，B1為0.5 μT，射頻脈沖持續時間4 s，FOV 30 mm×30 mm，余參數同混合Cr試管。連續波平面回波成像序列參數：B1 0.5 μT，射頻脈沖持續時間4 s，FOV 30 mm×30 mm，余參數同混合Cr試管。

1.3.3 圖像后處理 采用MATLAB(2013b)對原始數據進行后處理，通過連續波點分辨波譜序列圖像獲得試管及大鼠腦膠質瘤模型的Z譜及相應非對稱譜；于連續波平面回波序列圖像試管/大鼠腦膠質瘤中心區域(盡量與連續波點分辨波譜序列掃描ROI保持一致)及對側正常組織放置體素為3×3個的方形ROI，測量其Cr-CEST效應Cr-CESTR值，Cr-CESTR=(M-2 ppm-M+2 ppm)/M0，M-2ppm、M+2ppm、M0分別為頻率-2 ppm、+2 ppm、300 ppm處的信號強度，其中300 ppm處偏離水峰較遠，相當于未施加預飽和脈沖，取其絕對值的均值為最后結果，并獲得相應的Cr-CEST加權圖。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0統計分析軟件。計量資料采用中位數(上下四分位數)表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外實驗 于單一Cr試管的Z譜及非對稱曲譜(圖1)頻率2.0 ppm處見明顯波谷及波峰，提示存在Cr-CEST效應，且B1值為0.5～3.0 μT時Cr-CEST效應隨其增高而上升，B1值升至5.0 μT后Cr-CESTR效應降低。

圖1 不同射頻預飽和能量下單一Cr試管的Z譜(A)及非對稱曲譜(B)

混合Cr試管Z譜及非對稱曲譜(圖2A、2B)顯示，頻率2.0 ppm處Cr-CEST效應隨Cr濃度升高而增強。混合Cr試管Cr-CEST加權圖像(圖2C)亦顯示，Cr-CEST效應隨Cr濃度升高而增強，試管由藍色向紅色轉變，且隨B1值升高，Cr-CEST效應增強。B1值為0.5 μT時，20、40、60、80及100 mmol/L Cr試管的Cr-CESTR分別為6.31%、9.91%、14.46%、18.07%及21.45%；1.5 μT時，相應Cr-CESTR分別為16.75%、28.49%、37.66%、45.73%及49.87%；2.5 μT時分別為21.34%、34.84%、42.64%、50.75%及53.28%。

圖2 混合Cr試管的Cr-CESTR效應相關圖譜 A、B.分別為B1為1.0 μT時的Z譜(A)及非對稱譜(B)；C.B1 為0.5、1.5、2.5 μT時混合Cr試管的Cr-CEST加權圖像

2.2 體內實驗 成功制備8只大鼠膠質瘤模型，腫瘤T2WI呈高信號，邊界不清，占位效應明顯(圖3A)。大鼠腦膠質瘤Z譜及非對稱曲譜(圖3B、3C)顯示，B1值為0.5 μT時，于頻率2.0 ppm處見水信號減低，提示存在Cr-CEST效應；Cr-CESTR加權圖(圖4)顯示，腫瘤區域顏色較對側正常腦組織為淺，即Cr-CEST效應低于對側，頻率2.0 ppm處腫瘤區域Cr-CESTR絕對值[0.098(0.012,0.393)%]低于對側正常腦組織區域[3.499(3.072，3.656)%，Z=-3.361，P<0.001]。

圖3 大鼠腦膠質瘤模型Cr-CESTR效應相關圖譜 A.T2WI，黑框區域為掃描ROI；B.Z譜；C.非對稱譜

圖4 大鼠腦膠質瘤模型Cr-CEST效應圖 A.T2WI；B.Cr-CEST加權圖(方框為ROI)

3 討論

CEST技術利用特定高斯分布的預飽和脈沖對溶質中的特定物質進行預飽和，即射頻標記。假設有兩個溶質池，一個是自由水池，一個是可交換質子池。由于MR能探測氫質子信號，卻無法直接探測特定大分子質子池的信號。多種大分子物質內含有可與自由水進行化學交換的氫質子，在適當條件下(如適宜的溫度、pH)，交換質子池中的氫質子能與自由水池的氫質子發生化學交換，通過磁化傳遞探測水信號變化，間接反映溶質中特定的低濃度物質變化，從而顯示組織微環境的變化程度。CEST成像彌補了MRS空間分辨率低、不能獲得圖像的不足，得到探測物質的CEST效應圖可直觀顯示特定溶質分子微觀狀況下的濃度分布及變化。

SCHMIDT等[12]指出，溫度升高使CEST效應增強；而pH對CEST效應亦存在影響。本研究在恒定室溫、pH 7.0下進行觀察，以減少其他因素對Cr-CEST效應的影響。SUN等[13]發現B1與CEST效應并非呈無極限正相關，能量增高到一定程度后，CEST效應將發生溢出，即減低，故優化CEST掃描參數具有重要意義。本研究通過試管實驗優化掃描參數，發現相同條件下，B1值為0.5～3.0 μT時，Cr-CEST效應隨B1值增高而加強，而B1值增高至5.0 μT時CEST效應發生溢出[13]而有所下降；提示在一定范圍內提高B1值可提升Cr-CEST效應，但并非B1值越高則交換速率越快。隨Cr濃度增高，Cr-CEST效應增強，與既往研究[12]結果相符，這是由于濃度增高后，相同條件下質子池內可交換質子增多，導致交換增多，使水信號減低更明顯，而Cr-CEST效應增強。

在體實驗中的最佳B1值與Cr試管掃描并非完全相同。SINGH等[6]采用較低B1值(1.45 μT)對健康成人行頭部Cr-CEST成像。考慮到腦組織Cr濃度較低，其CEST效應相對試管而言較為微弱，較大B1值不利于活體成像，且B可能導致腦組織溫度增高而損害腦細胞，進而影響實驗結果，本研究采用B1值0.5 μT對大鼠腦膠質瘤進行Cr-CEST掃描，結果顯示大鼠膠質瘤頻率2.0 ppm處Cr-CEST效應絕對值較對側正常腦組織減低，提示其Cr濃度低于正常腦組織，與既往Cr-CEST研究[6,11]結果基本相符，并與MRS顯示腦膠質瘤腫瘤區域N-乙酰天門冬氨酸、Cr減低和膽堿增高[14]相呼應。

由于頻率-2.0～-3.5 ppm處存在核奧式效應[15-16]，無法去除-2.0 ppm處及附近部分物質交換的影響，計算Cr-CEST效應時，-2.0 ppm處存在水信號減低，難免影響結果，故Cr-CEST成像并非是絕對濃度成像，此為本研究不足之處。

綜上，Cr-CEST成像有助于評估大鼠腦膠質瘤模型Cr濃度變化，有望為活體檢測腦內Cr代謝提供影像學新方法。