熊果酸聯合阿霉素對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響*

王沙凝，李再巧，吳 沖，田 迪，葉桂芝，宋 羚，桂明英，馬 嘯,

(1.云南農業大學 普洱茶學院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色農業產業研究院，云南 昆明 650201)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，發病率僅次于乳腺癌，位居女性生殖系統惡性腫瘤首位，發病早期無特異性癥狀，部分出現癥狀就診時已進展至中晚期，目前多采用以手術和放化療為主的綜合治療方案，毒副作用較強[1-3]。阿霉素(doxorubicin，DOX)為蒽醌類高效廣譜化療藥物，用于臨床治療各類惡性腫瘤，具有較大副作用，主要體現在心肌損傷，并伴隨肌肉萎縮等不良癥狀，因此其臨床應用受限[4-5]。由于近年來女性患者人數逐漸增多，年齡逐漸年輕化，新型輔助藥物的開發顯得越發重要。熊果酸(ursolic acid，UA)，又稱烏索酸、烏蘇酸，為五環三萜類化合物，富含于苦丁茶中，苦丁茶老葉中熊果酸的平均含量為1.211%，嫩葉中熊果酸的平均含量為0.574%，具有廣泛的生物學活性[6-8]。許多研究發現：熊果酸能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤活性[9-11]。本研究通過將熊果酸與阿霉素聯合使用，初步探討其對宮頸癌HeLa 細胞增殖的影響，為熊果酸能否作為化療輔助藥物，減少阿霉素的使用劑量，以減輕抗癌藥物的毒副作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

UA 和DOX 均購自北京索萊寶科技有限公司；宮頸癌HeLa 細胞購自云南省細胞工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

細胞培養使用含10%胎牛血清(購自Hyclone 公司)、1%青鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)的DMEM 高糖培養基(購自Hyclone 公司)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，待細胞長滿培養皿80%～90%時，進行傳代培養。

1.2.2 MTT 檢測細胞存活率

將處于對數生長期的細胞以4×104個/mL的密度接種于96 孔板中，每孔200 μL，每組設5 個復孔，置于培養箱中進行貼壁培養。待細胞貼壁后，進行加藥處理，DOX 質量濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7、8 和9 mg/L；UA 濃度梯度為0、5、10、15 和20 μmol/L；聯用試驗組為2 mg/L DOX 分別與5、10、15 和20 μmol/L UA 聯用。將細胞進行藥物培養24 h，后加入MTT (購自上海碧云天生物技術有限公司)，每孔16 μL，繼續培養4 h，吸除培養基，每孔加入160 μL DMSO (購自北京索萊寶科技有限公司)，使用酶標儀進行震板并在492 nm 處檢測吸光值，計算細胞存活率，采用Prism 8.0 進行數據分析。

1.2.3 細胞形態學觀察

將處于對數生長期的細胞以1.25×105個/mL的密度、每皿4 mL 的體積接種于60 mm 培養皿中，放置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養。待細胞貼壁后，進行4 h 饑餓處理，后加藥處理，處理組分別為0 (CK)、20 μmol/L UA、2 mg/L DOX、5 mg/L DOX 和2 mg/L DOX+20 μmol/L UA。藥物培養24 h 后吸除培養基，使用PBS 沖洗2 次，在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 Hoechest 染色

將處于對數生長期的細胞以1.25×105個/mL的密度接種于6 孔板中，每孔接種2 mL。待細胞貼壁后，進行4 h 饑餓處理，后加藥處理，藥物處理劑量同1.2.3 節。藥物培養24 h 后吸除培養基，使用PBS 沖洗1 次，再加入1 mL培養基，并加入10 μL Hoechst 33342 活細胞染色液(100 ×)(購自上海碧云天生物技術有限公司)染色10 min，吸除培養基，用PBS 沖洗3 次，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.5 Western-blot 法檢測HeLa 細胞凋亡相關蛋白的表達

將處于對數生長期的細胞以1×106個/mL的密度、每皿4 mL 的體積接種于60 mm 培養皿中。待細胞貼壁后，進行4 h 饑餓處理，后進行加藥處理，培養12 h。收集處理后的各組細胞，用預冷的PBS (購自北京索萊寶科技有限公司)緩沖液洗細胞2 次，加入預冷的裂解液(購自上海美侖試劑有限公司) 100 μL 處理細胞，在冰上裂解30 min 后用4 ℃離心機14 000 r/min 高速離心15 min，收集上清液，進行BCA (購自上海碧云天生物技術有限公司) 蛋白定量檢測。采用濕轉膜法將目標蛋白轉移至PVDF 膜上，使用TBST 進行洗滌，5% 脫脂奶粉封閉1 h，后鋪一抗：Bax Antibody (購自Cell Signaling Technology)、Bcl-2 Antibody (購 自Cell Signaling Technology)、Caspase-3 Antibody (購自abcam)和Beta Tubulin Antibody (購自Cell Signaling Technology)，置于4 ℃搖床上孵育過夜。后鋪相應二抗室溫孵育1 h，經TBST 溶液洗滌后，將曝光液(購自北京四正柏生物科技有限公司)均勻滴在PVDF 膜置上進行曝光，并使用ImageJ 軟件對條帶灰度值進行分析，采用Prism 8.0 進行數據分析。

1.2.6 統計學分析

數據采用SPSS 17.0 軟件進行分析，單因素分析采用AVONA 進行數據處理，圖像處理采用imageJ，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 UA 與DOX 單獨使用對HeLa 細胞存活率的影響

當UA 濃度為5 μmol/L 時，HeLa 細胞存活率與對照組不存在顯著差異(圖1)；當UA 濃度增加至10 μmol/L 以后，細胞存活率極顯著低于對照組(P＜0.01)，抑制效果增強；當UA 濃度為20 μmol/L 時，細胞存活率最低，抑制效果最為顯著。當DOX 質量濃度為1～3 mg/L 時，HeLa 細胞存活率與對照組相比顯著降低(P＜0.01)；當DOX 質量濃度為3～8 mg/L 時，雖然與對照組相比顯著降低(P＜0.01)，但處理組之間不存在顯著差異。

圖1 UA 與DOX 單獨使用對HeLa 細胞存活率的影響)Fig.1 The effects of UA and DOX uesed alone on the survive rate of HeLa cells

2.2 UA 與DOX 聯用對HeLa 細胞存活率的影響

選取5、10、15、20 μmol/L UA 分別與2 mg/L DOX 進行聯用，由圖2 可知：4 組不同濃度的UA 和2 mg/L DOX 聯用分別與2 mg/L DOX 單獨使用相比，細胞存活率均極顯著降低(P＜0.01)，且4 個聯用組的細胞存活率均極顯著低于5 mg/L DOX 單獨使用；5、10、15 μmol/L UA 與2 mg/L DOX 的3 組聯用分別與相應的3 個不同濃度的UA 單獨使用相比，細胞存活率均極顯著降低(P＜0.01)，而20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 聯用與20 μmol/L UA 相比，細胞存活率不存在顯著差異，但顯著低于15 μmol/L UA 單獨使用，達到UA 與DOX 聯用作用效果最高劑量。

圖2 UA 和DOX 聯用對HeLa 細胞存活率的影響)Fig.2 The effect of the combination of UA and DOX on the survival rate of HeLa cells

2.3 UA 與DOX 聯用細胞形態學觀察

細胞具有表面結構和自身表面張力，以及受到外界的機械壓力，能夠保持一定的形態。細胞形態學觀察發現(圖3)：經20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 單獨給藥處理的HeLa 細胞的形態由梭狀轉變為不規則形狀，細胞密度降低、細胞分離數增加；經5 mg/L DOX 單獨處理的HeLa 細胞形態明顯皺縮，由梭狀變為圓形，細胞密度明顯降低；聯用組(20 μmol/ UA+2 mg/L DOX)處理的HeLa 細胞形態變化最為明顯，由梭狀變為圓形，而細胞密度變化不太明顯。

圖3 HeLa 細胞形態)Fig.3 Cell morphology of HeLa

2.4 UA 與DOX 聯用細胞凋亡觀察

Hoechst 是一種可穿透細胞膜的藍色熒光探針，常用細胞凋亡檢測。在熒光顯微鏡下，活細胞核呈現彌散均勻熒光；出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如圖4 所示：聯用組(20 μmol/L UA+2 mg/L DOX)給藥處理的HeLa 細胞出現較強的濃染致密的顆粒塊狀熒光(紅色圓圈所示)。因此，聯用組細胞凋亡數量高于單獨用藥組。

圖4 Hoechest 染色)Fig.4 Staining of Hoechest

2.5 HeLa 細胞促凋亡相關蛋白的表達

相關促凋亡蛋白的表達結果如圖5 所示：對于Cleaved caspase-3 蛋白表達量，聯合用藥組(20 μmol/L UA +2 mg/L DOX)顯著高于20 μmol/L UA 單獨使用(P＜0.05)，但與2 mg/L DOX 相比，沒有顯著差異；聯用組Bax/Bcl-2 表達量分別與20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 單獨使用相比，也沒有顯著差異。

3 討論

本研究MTT 結果顯示：熊果酸可顯著降低HeLa 細胞的活性，與阿霉素聯用效果高于2 種藥物單獨使用效果，且高于較高質量濃度的阿霉素單獨使用效果，這發揮了熊果酸抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用[10]。

在細胞形態學中，二者聯用對細胞形態的影響較為明顯；細胞凋亡觀察結果中發現：出現較強的濃染致密的顆粒塊狀熒光，即凋亡細胞數較多。此外，有研究表明：經熊果酸可誘導人乳腺癌細胞凋亡，導致核固縮，細胞核呈致密濃染的顆粒塊狀熒光[12]，該結果與本試驗結果一致。

關于促凋亡蛋白，半胱天冬蛋白酶Caspase-3是細胞凋亡的級聯反應途徑中的執行者，在Caspase 家族介導的凋亡通路中，級聯反應最終聚集于此，并將刺激信號往下傳導，可與大量的蛋白因子共同調控細胞凋亡，具有不可逆作用[13]。Caspase-3 活化可導致細胞凋亡進入不可逆階段，最終使得核小體間DNA 降解，細胞發生凋亡[13-15]；B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因即Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抗凋亡作用。Bax是Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白，具有促進細胞凋亡的功能，在通過線粒體應激誘導的細胞凋亡中起關鍵作用，是細胞凋亡內源性線粒體途徑的重要調節因子，通常以二者比值判斷細胞凋亡狀態。有研究表明：線粒體跨膜電位的改變預示細胞可能出現凋亡[16]。熊果酸可保護心臟免受阿霉素引起的傷害，其通過增加AKT 磷酸化水平和增強內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達，同時抑制阿霉素誘導的eNOS 通過NADPH 氧化酶4 (NOX4)下調解偶聯[17]。本試驗結果提示：二者聯用可達到減少阿霉素毒副作用的效果。有研究表明：高劑量熊果酸(50 mg/kg)可以降低阿霉素腎病小鼠的尿蛋白，抑制腎小管間質TGF-β1 蛋白的表達，減輕阿霉素的毒副作用[18]。Western-blot 結果顯示：Cleaved caspase-3 蛋白含量(圖5)聯用組低于高劑量阿霉素組，與熊果酸單獨用藥組存在差異性(P＜0.05)，但與低劑量阿霉素組不存在差異性，這可能與熊果酸的給藥劑量有關。相關研究顯示：20～50 μmol/L 熊果酸作用于HuH7 肝癌細胞8 h 后，能呈劑量依賴性地下調凋亡相關蛋白(XIAP) 的表達量[19]。而Bax 蛋白含量不存在差異性，可能是進行了細胞核凋亡途徑，此外，還可能與藥物作用時間、給藥濃度以及相關凋亡通路有關，具體作用機制還有待深入研究。

圖5 促凋亡蛋白的表達量)Fig.5 Levels of proteins associating with apoptosis

4 結論

MTT 結果顯示：熊果酸與阿霉素聯用效果高于2 種藥物單獨使用效果；聯用效果在細胞形態學結果中變化最為明顯，由梭狀變為圓形，且在熒光染色中出現較強的濃染致密的顆粒塊狀熒光，細胞凋亡較多。而根據相關細胞凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 的表達量結果顯示：二者聯用的作用機制可能是進行了細胞核凋亡途徑，具體機制仍需探究。因此，二者在一定程度上減少阿霉素的使用劑量，增強阿霉素對宮頸癌HeLa 細胞的治療作用。