土壤耕層重構(gòu)對烤煙農(nóng)藝性狀和根際土壤微生物多樣性的影響*

李 震，張清壯，許石劍，羅富方，劉勝傳，宋莉丹，李 鑫

(1.貴州省煙草公司黔西南州公司，貴州 興義 562400；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410128；4.湖南省科學(xué)技術(shù)事務(wù)中心，湖南 長沙 410013)

烤煙作為貴州主要支柱產(chǎn)業(yè)之一，烤煙種植是煙農(nóng)增收和脫貧致富的重要途徑。土壤養(yǎng)分及生態(tài)平衡狀況是影響煙草品質(zhì)的基本條件，而由于受烤煙傳統(tǒng)種植習(xí)慣的影響，一味追求高產(chǎn)而大量施用化肥以及連作種植模式突出導(dǎo)致植煙土壤性質(zhì)劣化、土壤板結(jié)、耕作層變淺和犁底層上移，煙田生態(tài)功能降低，有益微生物種類和數(shù)量降低，從而影響煙株的生長發(fā)育和烤煙產(chǎn)質(zhì)量下降[1]。如何通過烤煙—土壤—微生物建立適宜于區(qū)域烤煙可持續(xù)發(fā)展的土壤保育技術(shù)，對促進(jìn)烤煙種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、提高烤煙產(chǎn)質(zhì)量和煙農(nóng)收入具有重要意義。

土壤微生物不僅是維持土壤生化活性的重要組成部分，還是植物生長的活性營養(yǎng)庫，能改善土壤理化性質(zhì)、參與土壤的養(yǎng)分循壞和礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生化過程，是反映土壤健康的有效指標(biāo)[2]。土壤微生物多樣性降低，有益微生物減少，病原菌增加，會引起土壤酸化，改變土壤有效養(yǎng)分，是連作障礙主要成因之一，最終將導(dǎo)致烤煙生長發(fā)育受阻、產(chǎn)質(zhì)量降低[3]。為了防治烤煙連作障礙，采取一系列有效的消減措施，如輪作、間作套種、施用生物有機(jī)肥、選用抗病品種和生物防治等[4]。煙草與其他作物輪作及間套作對于改善土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和消減煙草連作障礙具有很好效果[5]。徐潔等[6]表明：添加生物有機(jī)肥能改變土壤中的微生物尤其是有益微生物的數(shù)量與結(jié)構(gòu)，促進(jìn)煙草生長，提高烤煙的產(chǎn)質(zhì)量。土壤耕層重構(gòu)主要是通過現(xiàn)代化機(jī)械手段，將表層土壤0～20 cm 與＞20～40 cm進(jìn)行互換，試圖通過土壤耕層的重新構(gòu)筑，改良土壤結(jié)構(gòu)，提升土壤肥力，解決煙田連作生產(chǎn)中存在的諸多弊病[7-8]。目前有關(guān)耕層重構(gòu)對烤煙土壤微生物多樣性的影響尚未系統(tǒng)研究。

本研究擬利用耕層重構(gòu)技術(shù)解決黔西南煙區(qū)煙田生態(tài)功能降低、病蟲害加重和烤煙生產(chǎn)力下降的問題，基于大田試驗(yàn)，研究耕層重構(gòu)對煙田土壤微生物多樣性和烤煙農(nóng)藝性狀的影響，以期通過耕層重構(gòu)改善烤煙土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)煙株生長發(fā)育，為該煙區(qū)特色優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)和煙葉可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2019 年在興義市興仁縣雨樟鎮(zhèn)交樂村立山坪(N25°20′53″，E105°7′49″)進(jìn)行，海拔1 560 m，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候。供試品種為云煙97，由黔西南州煙草公司興義市分公司提供。

土壤基礎(chǔ)理化性狀：pH 為5.15，有機(jī)質(zhì)含量為27.85 g/kg，全氮含量為1.78 g/kg，堿解氮含量為134.06 mg/kg，有效磷含量為6.56 mg/kg，速效鉀含量為313.95 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，于2018 年10 月中下旬進(jìn)行土壤置換處理，2019 年4 月下旬起壟移栽；設(shè)置3 個處理。T1：對照，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)旋耕，旋耕深度0～15 cm；T2：0～20 cm 土壤與＞20～40 cm 土壤互換，旋耕深度30 cm；T3：0～15 cm土壤與＞15～30 cm 土壤互換，旋耕深度30 cm，每個處理3 個重復(fù)，共9 個小區(qū)，小區(qū)面積為111.1 m2。

具體做法：(以T3為例)使用動力160 kW 拖拉機(jī)帶動旋轉(zhuǎn)式主副深翻犁1 次，將0～15 cm 土壤與＞15～30 cm 土壤進(jìn)行互換。株行距為1.2 m×0.5 m，4 月21 日開始移栽，試驗(yàn)田的施肥情況為：施用煙草專用肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=12∶12∶14] 750 kg/hm2，硫酸鉀225 kg/hm2，有機(jī)肥1 200 kg/hm2。其他栽培管理措施均與當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)中的管理措施完全一致。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 烤煙農(nóng)藝性狀測定

在打頂后10 d 測定煙株農(nóng)藝性狀，參照YC/T 142—2010 標(biāo)準(zhǔn)，每個小區(qū)定點(diǎn)選擇生長比較一致的健壯煙株5 株，測定株高、莖圍、有效葉片、最大葉長和最大葉寬等指標(biāo)，烘烤后測定各小區(qū)產(chǎn)量，并折算成單位面積產(chǎn)量。

1.3.2 土壤樣品采集

在烤煙采收后，各處理采用抖落法采集煙株根際土壤，混勻，用無菌自封袋包裝，放入冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱，用于提取土壤DNA，分析微生物多樣性。

1.3.3 土壤微生物的測序與多樣性分析

所有土壤樣品使用特定DNA 提取試劑盒進(jìn)行微生物的總DNA 提取，后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。確定質(zhì)量合格后將DNA樣本低溫送至上海北滬生物科技有限公司完成擴(kuò)增子測序。采用Illumina MiSeqTM測序技術(shù)進(jìn)行測定。

微生物多樣性分析使用QIIME 軟件執(zhí)行。α 多樣性分析用于評估微生物群落的豐富度和多樣性[9]。Ace 和Chao 豐富度指數(shù)用于估計群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高；Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，數(shù)值越高表明群落多樣性越高；β 多樣性分析用于研究不同樣本群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系以及與環(huán)境因子的相關(guān)性。最后進(jìn)行主成分分析(PCA)以便區(qū)分不同處理后群落結(jié)構(gòu)的變化差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS 和RStudio 軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、方差分析、各分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)柱形圖和主成分分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 耕層重構(gòu)對烤煙農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響

從表1 可見：處理組(T2、T3)烤煙農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量與對照(T1)差異顯著。從煙株株高來看，對照T1的株高顯著低于處理組(P＜0.05)，其中T2處理最高。煙株莖圍、有效葉數(shù)、最大葉面積和產(chǎn)量均以T2處理最高。T2和T3處理組產(chǎn)量較T1對照組分別提高14.31%和7.32%，說明耕層重構(gòu)改變了土壤結(jié)構(gòu)分布，顯著改善影響煙葉生長發(fā)育的各構(gòu)成因素，從而對煙葉的生長起到促進(jìn)效果。綜合農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量來看，T2、T3處理優(yōu)于T1對照組。

表1 耕層重構(gòu)對烤煙農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響Tab.1 Effect of tilth layer reconstruction on the agronomic characters and yield of flue-cured tobacco

2.2 耕層重構(gòu)對植煙土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性的影響

2.2.1 α 多樣性

從表2 可見：細(xì)菌群落中，與對照T1相比，T2和T3土壤耕層重構(gòu)的處理顯著提高了Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)(P＜0.05)。4 個群落多樣性指數(shù)的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為T2＞T3＞T1，其中T2的Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)比T1分別提高41.28%、39.56%和26.44%，T3的各指數(shù)較T1分別提高36.78%、34.78%和22.46%，而Simpson 指數(shù)在各組群落間差異不顯著。與細(xì)菌群落多樣性結(jié)果相反，真菌群落中T2和T3處理的Ace、Chao、Shannon 和Simpson 指數(shù)值都顯著低于對照T1。以T3中Ace 和Shannon 指數(shù)值下降最大，分別較對照T1下降35.49%和38.00%。由此可見，耕層重構(gòu)提高了細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，降低了真菌群落的豐富度和多樣性，土壤耕層重構(gòu)后的土壤環(huán)境更有利于細(xì)菌的生長繁殖。

表2 植煙土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性指數(shù)Tab.2 Indexes of bacterial and fungal community diversity in tobacco-growing soil

2.2.2 β 多樣性

由圖1a 細(xì)菌主成分分析(PCA)可知：第一主成分(PC1)的方差貢獻(xiàn)率為77.9%，第二主成分PC2 的方差貢獻(xiàn)率為15.9%，累積達(dá)到93.8%。對照T1分布在第二象限，T2處理分布在第四象限，T3處理分布在第一象限。在PC1 上，耕層重構(gòu)處理的土壤細(xì)菌OTU 分布具有相對一致性，且與對照T1存在較大差異；在PC2 上，T1和T3處理的土壤細(xì)菌OTU 分布差異較小。

由圖1b 真菌主成分分析可知：PC1 的方差貢獻(xiàn)率為48.4%，PC2 的方差貢獻(xiàn)率為18.6%，累積達(dá)到67.0%。真菌在主成分軸上的變化趨勢與細(xì)菌一致。耕層重構(gòu)對微生物群落功能多樣性的影響在空間距離差異上分布較明顯，表明耕層重構(gòu)導(dǎo)致土壤微生物群落功能改變。

圖1 土壤樣品細(xì)菌(a)、真菌(b) PCA 分析圖)Fig.1 PCA analysis of bacteria (a) and fungi (b) in soil samples

2.3 耕層重構(gòu)對植煙土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

采用高通量測序技術(shù)對土壤微生物多樣性進(jìn)行分析，不同處理微生物群落在門、屬水平的相對豐度如圖2 所示。在門水平上(圖2a)，各處理中細(xì)菌主要由綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)和酸桿菌門組成。與T1相比，T2和T3處理土壤中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門相對豐度明顯降低，綠彎菌門、奇古菌門、酸桿菌門和浮霉菌門相對豐度明顯升高，其中擬桿菌門降低的最多，綠彎菌門提高的最多。T2和T3處理群落組成相似。屬水平上(圖2b)，T2、T3處理組中Nitrososphaeraceae、Sbr1031、Subgroup 6 和Anaerolineaceae 的相對豐度較T1顯著增加，而Muribaculaceae、Cmig08 和Ralstonia的相對豐度明顯降低。

圖2 土壤樣品在細(xì)菌(a、b)和真菌(c、d)門、屬分類水平上相對豐度變化)Fig.2 Changes in relative abundance of soil bacteria (a,b) and fungi (c,d) samples at phylum and genus levels

由圖2c 可知：土壤中的真菌主要由子囊菌門(Ascomycota)構(gòu)成，所占比例達(dá)74.67%～86.53%。不同處理對真菌相對豐度變化不同，T2較T1土壤中的子囊菌門相對豐度明顯升高，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對豐度明顯降低，降幅為12.13%，而T3較T1土壤中的子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度無顯著差異，壺菌門(Chytridiomycota)相對豐度明顯升高，增幅為6.40%，T3較T1和T2處理土壤中的球囊菌門(Glomeromycota)相對豐度明顯降低。屬水平上(圖2d)，T2和T3組中曲霉屬相對豐度顯著增加，管柄囊霉屬(Funneliformis)在T2中顯著增加。

2.4 耕層重構(gòu)中優(yōu)勢菌群與烤煙生長的關(guān)系

由表3 可知：株高與酸桿菌門、浮霉菌門、曲霉屬和翹孢霉屬的相對豐度呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.596、0.639、0.585和0.645。有效葉數(shù)與株高存在相似規(guī)律，其相關(guān)系數(shù)分別為0.714、0.767、0.671 和0.629。

表3 優(yōu)勢菌門、屬與烤煙生長參數(shù)的相關(guān)性分析Tab.3 Pearson correlation analysis between growth parameters of tobacco and abundant bacterial phylum and genera

3 討論

土壤耕層重構(gòu)(T2和T3)后種植的烤煙比對照土壤上種植的煙株(T1)有明顯的生長優(yōu)勢，其株高、莖圍、有效葉數(shù)、最大葉面積和產(chǎn)量等指標(biāo)均比對照增加，其中增產(chǎn)幅度達(dá)到14.31%。耕層重構(gòu)技術(shù)運(yùn)用于其他農(nóng)作物上均與該試驗(yàn)表現(xiàn)出一致的效果。王樹林等[7]研究表明：耕層重構(gòu)后棉花生長表現(xiàn)出明顯的后發(fā)優(yōu)勢，具有抗旱耐澇作用，可有效提高棉花產(chǎn)量。孟慶英等[10]研究表明：土層置換可顯著增加大豆、馬鈴薯和甜菜的產(chǎn)量。盧佳等[11]研究表明：土層置換處理后玉米生長勢及產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)均有一定程度的提高。

耕層重構(gòu)促進(jìn)烤煙生長可能有2 個原因：一是通過有益微生物改善理化性質(zhì)，提升土壤養(yǎng)分含量來促進(jìn)作物生長；二是抑制或阻撓病原菌的發(fā)展，間接促進(jìn)作物的生長。土壤微生物在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和碳氮循環(huán)中起著尤為重要的作用[12]，其微生物多樣性與土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明：T2和T3處理土壤中細(xì)菌Ace指數(shù)、Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均顯著高于T1對照組，真菌各項(xiàng)多樣性指數(shù)則顯著低于T1對照組，說明耕層重構(gòu)提高了植煙土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性，降低了真菌的豐富度和多樣性，符合健康的“細(xì)菌型”土壤的標(biāo)準(zhǔn)。耕層重構(gòu)后土壤中曲霉屬、浮霉菌門和酸桿菌門的相對豐度顯著增加，與烤煙株高和有效葉數(shù)呈正相關(guān)。曲霉菌是一種適應(yīng)能力較強(qiáng)的腐生真菌，能夠在高營養(yǎng)、低營養(yǎng)以及強(qiáng)滲透脅迫下生存繁殖[14]。曲霉菌廣泛存在于植物體內(nèi)，對植物生長和抵抗逆境有一定作用，主要通過分泌到植物組織中的一些物質(zhì)發(fā)揮作用，如激素(茉莉酸、吲哚乙酸和水楊酸)、黃酮類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)和脯氨酸等[15-16]。植物可以利用這些真菌細(xì)胞外生物過程釋放的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，或通過這些激素類物質(zhì)的信號，植物能夠即時響應(yīng)并抵御外界脅迫環(huán)境[16]。浮霉菌門在氮循環(huán)中起重要作用，是一種典型的厭氧氨氧化細(xì)菌，而氨氧化微生物在菜田土壤氮循環(huán)中，對于增加土壤氮含量、改變氮的形式和增強(qiáng)植物對氮的有效利用至關(guān)重要[17]。酸桿菌門能通過改善土壤pH 進(jìn)而有益于植物的生長。對于土壤中的拮抗微生物，本研究中T2處理翹孢霉屬和管柄囊霉屬顯著增加。翹孢霉屬是一種鐮刀枯萎病的生防拮抗菌[18]。管柄囊霉屬對致病菌生長有明顯的抑制作用，能夠降低植物感病率，改善烤煙生長環(huán)境，促進(jìn)烤煙生長[19]。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：通過0～20 cm 土壤與＞20～40 cm土壤互換，旋耕深度30 cm 的方式進(jìn)行耕層重構(gòu)后種植煙草，其農(nóng)藝性狀最佳，產(chǎn)量最高(較未處理土壤提高14.31%)。同時微生物群落分析表明耕層重構(gòu)能夠提高微生物多樣性指數(shù)，增加有益微生物曲霉屬、浮霉菌門和酸桿菌門的相對豐度。因此，對植煙土壤進(jìn)行耕層重構(gòu)可以改善烤煙土壤微生態(tài)環(huán)境，是一種促進(jìn)煙草發(fā)育、增加煙葉產(chǎn)量和緩解煙田連作障礙的有效耕作措施。此外，耕層重構(gòu)也為構(gòu)建健康煙田土壤生態(tài)系統(tǒng)提供了一種新的途徑和實(shí)踐參考。