盤龍七片調(diào)控Toll樣受體4-骨髓樣分化因子88-核因子-κB通路保護(hù)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織

林朋朝，周曉彬，高偉靜，姬艷林，馮建書，李靜

作者單位：1石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷三科，河北 石家莊050000；2河北省老年病醫(yī)院護(hù)理部，河北 石家莊050000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）作為一種免疫性全身性疾病，其病理基礎(chǔ)為滑膜炎，隨著疾病的進(jìn)展會(huì)引起關(guān)節(jié)畸形進(jìn)而致殘。目前RA的具體發(fā)病機(jī)制仍未闡明，但相關(guān)研究證實(shí)Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）-骨髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路在RA的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的Toll蛋白受體家族成員，能夠識(shí)別抗原分子從而介導(dǎo)機(jī)體的固有免疫及獲得性免疫來參與多種疾病的發(fā)生，其被激活后會(huì)誘導(dǎo)下游MyD88大量合成，繼續(xù)激活下游炎性細(xì)胞遞質(zhì)白細(xì)胞介素-1（IL-1）受體，并最終激活NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生。RA屬于中醫(yī)學(xué)中的“痹癥”范疇，中醫(yī)認(rèn)為痹癥是由風(fēng)寒濕邪所致，應(yīng)當(dāng)以祛風(fēng)除濕散寒為主治。盤龍七片是中醫(yī)骨傷科專家王家成先生所獻(xiàn)秘方，主要發(fā)揮補(bǔ)血活血、行氣止痛、祛風(fēng)散寒、除濕補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨等作用。目前研究表明盤龍七片治療RA效果良好，但其具體的作用機(jī)制尚未有研究報(bào)道，本次研究于2018年5月至2019年6月通過建立RA模型大鼠后，給予不同劑量盤龍七片處理，來觀察其對(duì)TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路的影響，旨在為盤龍七片治療RA的具體作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量范圍為160～200 g，購于中國(guó)食品藥品檢定研究院［SCXK（京）2014-0013］，飼養(yǎng)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院屏障環(huán)境動(dòng)物房［SYXK（京）2014-0033］，光照12 h/黑暗12 h，室溫（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～65%，全天自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑及儀器

盤龍七片（陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)Z61020050）；弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)068K8761）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1酶聯(lián)免疫試劑盒（上海恒斐生物科技有 限 公 司，批 號(hào)20160128、20151210）；TLR4、MyD88、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物均由上海生工合成；兔抗大鼠NF-κB p65、p-p65、β-actin抗體（美國(guó)Abcam公司購買）；Revertaid First Strand cDNA Kit試劑盒（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)00145205）；PCR儀（PIKOREAL 96型）由美國(guó)Thermo公司提供；酶標(biāo)分析儀（RI-6000型）由美國(guó)雷杜公司提供；臺(tái)式離心機(jī)（TDL-4型）由上海安亭科學(xué)儀器廠提供；凝膠自動(dòng)成像儀由瑞典Pharmacia公司提供；光學(xué)顯微鏡（BX 51型）由日本Olympus公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備處理

將50只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、低、中、高盤龍七片組，每組10只，除正常組外，其余組大鼠均放置在特制的裝置中，保持裝置內(nèi)溫度為（4±2）℃，風(fēng)扇風(fēng)力4級(jí)，濕度保持在85%～90%，連續(xù)飼養(yǎng)20 d后，在每組大鼠右后足墊部位注射0.15 mL的弗氏完全佐劑，注射24 h后大鼠右足踝部出現(xiàn)急性炎性腫脹，48 h后注射側(cè)及非注射側(cè)前肢關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹，表明造模成功，正常組大鼠在室溫18～20℃條件下正常飼養(yǎng)。造模成功后3 d開始，低、中、高盤龍七片組大鼠灌胃給予150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg劑量的盤龍七片溶液，1次/天，連續(xù)15 d。

1.4 血液樣本及滑膜組織樣本收集

末次處理后，10%水合氯醛麻醉，取腹主動(dòng)脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min后收集上清，保存于-20℃待測(cè)；各組大鼠取血后處死，沿右側(cè)膝關(guān)節(jié)上方正中行縱向切口，取出滑膜組織后，一部分4%甲醛固定用于病理學(xué)觀察，一部分立刻裝入RNase free的離心管中，于液氮中快速冷凍后，保存于-80℃超低溫冰箱中。

1.5滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察

將“1.4”收集的甲醛固定好的滑膜組織經(jīng)過脫鈣、脫水、石蠟包埋后，連續(xù)切片成厚度為4 μm的切片，經(jīng)烤片、脫蠟后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察滑膜組織病理形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

1.6 血清中TNF

-α

、IL

-

1水平的檢測(cè)

取“1.4”中抽提的血液樣本，由嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)血清TNF-α、IL-1水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)各組大鼠滑膜組織中細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAF

-

6的mRNA表達(dá)水平

取“1.4”中收取的各組大鼠滑膜組織50 g，采用Trizol試劑提取總RNA，Revertaid First Strand cDNA合 成 試 劑 盒 將RNA中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR-Green PCR Mix檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。PCR參數(shù)設(shè)置：95°C 5 s，60°C 34 s、40個(gè)循環(huán)。所用引物（上海生工）信息如下：β-actin內(nèi) 參 基 因，正 向 引 物5’-CCCATCTAATGAGGGTTACGC-3’、反向引物5’-TTTAATGTGACGCACGATTTC-3’；TLR4，正 向 引 物5’-AACATGAGTCACAACAACCTAC-3’、反 向 引 物5’-TATTCACATATACAAGCAACAG-3’；MyD88，正 向引物5’-ATTGAGAAAAGGTGTCGTCGCAT-3’、反向引 物5’-TCGCAGATAGTGATGAACCGTAGG-3’；TRAF-6，正向引物5’-CTGCTTGATGGCTTTACGGGA-3’、反 向 引 物5’-CTGGGCACTTGTGACCTGCAT-3’。用2法分析相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組滑膜組織中NF

-κ

B p65蛋白表達(dá)水平

取“1.4”中收取的各組大鼠滑膜組織100 g，加入胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度一致后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗鼠NF-κB p65、p-p65、β-actin一抗（1∶500）4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育2 h，顯色后暗室曝光到X線片上，分析各組條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)內(nèi)參β-actin的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 盤龍七片對(duì)RA模型大鼠滑膜組織病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞連續(xù)平整，結(jié)構(gòu)層次清晰，無滑膜腫脹、組織壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況發(fā)生，與正常組相比，模型組滑膜組織可見明顯變性壞死，滑膜處可見中度充血水腫，且有大量炎細(xì)胞并伴隨輕度滑膜增生，與模型組相比，不同劑量盤龍七片處理后關(guān)節(jié)變性壞死情況明顯改善，滑膜組織充血水腫情況減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況極大的改善，且呈濃度依賴。見圖1。

2.2 盤龍七片對(duì)各組SD大鼠血清中TNF

-α

、IL

-

1

水平的影響

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平顯著高于對(duì)照組，不同劑量盤龍七片組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平均低于正常組，且呈濃度依賴（

P

＜

0.05

）。見表1。

表1 各組SD大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）水平比較/（μg/L，±s）

2.3 盤龍七片對(duì)各組SD大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88、TRAF

-

6的mRNA表達(dá)水平的影響

模型組滑膜組織中TLR4、MyD88、TRAF-6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于正常組，不同劑量盤龍七片組滑膜組織中TLR4、MyD88、TRAF-6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于模型組，且呈濃度依賴（

P

＜0.05）。見表2。

表2 各組SD大鼠滑膜組織中Toll樣受體4（TLR4）、骨髓樣分化因子88（MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）的mRNA表達(dá)水平/±s

2.4 盤龍七片對(duì)各組SD大鼠滑膜組織中NF

-κ

B p65蛋白表達(dá)水平的影響

各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65蛋白磷酸化水平整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=118.023，

P

＜0.001）。其中模型組（1.37±

0.22

）高于正常組（0.21±0.06），低、中、高盤龍七片組分別為（0.95±0.14）、（0.75±0.12）、（0.33±0.09），均低于模型組，且呈濃度依賴（

P

＜0.05）。見圖2。

圖2 各組SD大鼠滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)圖譜

3 討論

目前研究結(jié)果表明，RA滑膜組織處大量合成炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為是引起RA炎性反應(yīng)和滑膜損傷的重要因素。TNF-α和IL-1是RA發(fā)病機(jī)制中研究最多的2個(gè)促炎性細(xì)胞因子，當(dāng)機(jī)體處于RA病理狀態(tài)時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的大量炎性遞質(zhì)會(huì)進(jìn)入滑膜組織，引起滑膜組織中細(xì)胞因子平衡失調(diào)，IL-1、TNF-α等促炎性因子水平升高，抑炎性因子水平降低，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，RA模型大鼠可見關(guān)節(jié)滑膜明顯的變性壞死，并伴隨有中度充血腫脹，同時(shí)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜輕度增生，同時(shí)腹主動(dòng)脈血清中IL-1、TNF-α水平也顯著升高，表明RA模型大鼠病變過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子平衡失調(diào)，而IL-1、TNF-α水平升高會(huì)促進(jìn)膠原酶及自由基的產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷關(guān)節(jié)軟骨。經(jīng)過盤龍七片治療后，主動(dòng)脈血清中IL-1、TNF-α水平顯著降低，關(guān)節(jié)變性壞死情況明顯改善，滑膜組織充血水腫情況減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況極大的改善，其中盤龍七片600 mg/kg治療緩解效果最好，這是因?yàn)楸P龍七片藥方中的川烏、草烏能夠刺激垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的表面麻醉作用，可用于止痛，而盤龍七具有補(bǔ)脾健胃、除濕利水活血功效，能夠改善循環(huán)，促進(jìn)炎性細(xì)胞遞質(zhì)的代謝，來達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的作用，丹參具有抗氧化、抗炎的功效，還可以抑制CRP蛋白的合成，牛膝中富含阿魏酸能夠提高細(xì)胞免疫功能，秦艽主祛風(fēng)除濕之效，常用于骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的治療，因此對(duì)于RA模型大鼠的滑膜組織損傷可以起到很好的保護(hù)作用。

RA作為一種系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其具體發(fā)病機(jī)制仍未研究清楚，但炎癥反應(yīng)過程對(duì)RA的發(fā)病及病理過程影響巨大。TLR4-MyD88-NF-κB作為研究RA最多的一個(gè)經(jīng)典通路，在RA發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，Toll樣受體在很多免疫細(xì)胞上均可檢測(cè)到，其中TLR4在早期和持續(xù)期RA病人的滑膜組織中表達(dá)水平顯著升高，而活化的TLR4通過MyD88依賴途徑首先活化IL-1受體激酶（IRAK），活化后的IRAK又會(huì)與TRAF6結(jié)合，激活TAK1激酶，繼續(xù)作用于NF-κB上游抑制蛋白IκB使其降解，NF-κB被釋放激活后，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)炎性反應(yīng)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，完成炎性反應(yīng)信號(hào)的傳遞。本研究結(jié)果中，RA模型大鼠TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平及p65蛋白磷酸化均顯著升高，表明RA病理變化過程與自身免疫相關(guān)，同時(shí)NF-κB信號(hào)通路激活后下游炎性相關(guān)因子表達(dá)增強(qiáng)，使得前炎性細(xì)胞因子水平迅速升高，這些前炎性細(xì)胞因子能通過與巨噬細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，誘發(fā)級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，誘導(dǎo)更多促炎性因子合成，形成級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，使關(guān)節(jié)滑膜處持續(xù)保存過度炎癥反應(yīng)，引起滑膜組織的持續(xù)性損傷。盤龍七片處理后，TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平及p65蛋白磷酸化水平均顯著降低，表明盤龍七片可能是通過抑制TLR4的識(shí)別過程，中斷與MyD88的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制了NF-κB信號(hào)通路的激活，減少前炎性因子合成，緩解炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)滑膜組織的破壞及異常增生。

綜上所述，盤龍七片可能通過下調(diào)TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，抑制下游信號(hào)原件NF-κB激活，使得促炎性因子IL-1、TNF-α合成減少，炎癥反應(yīng)減輕從而保護(hù)滑膜組織。但盤龍七片是否還可以通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多靶點(diǎn)促進(jìn)或抑制來治療RA還不清楚，還需要繼續(xù)的深入研究。

注：箭頭處為滑膜組織。