山茱萸環(huán)烯醚萜苷通過介導(dǎo)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路對(duì)急性腦梗死小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

葛海，何艮霞，朱迎春，李軍

作者單位：安徽省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 合肥230041

通信作者：李軍，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)內(nèi)科常見疾病內(nèi)科治療，Email：439712162＠qq.com

急性腦梗死又稱為缺血性腦卒中，腦組織血氧供應(yīng)不足，再加上缺血后再灌注等損傷，均會(huì)造成神經(jīng)元的凋亡。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，是MAPKs家族主要成員之一，參與細(xì)胞編碼相關(guān)基因和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2磷酸化在腦梗死后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。山茱萸環(huán)烯醚萜苷（Cornus iridoid glycoside，CIG）是山茱萸科植物山茱萸的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用，可促進(jìn)缺血大鼠的血管生成和神經(jīng)發(fā)生并減輕腦缺血大鼠的細(xì)胞凋亡和炎癥，改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸可能通過激活ERK途徑，作用機(jī)制可能是ERK1/2磷酸化水平增高，可以調(diào)節(jié)樹突蛋白合成，影響與神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)翻譯起始因子的磷酸化狀態(tài)，提高老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；山茱萸多糖改善老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力通過激活ERK途徑實(shí)現(xiàn)。另有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可抑制核因子-κB（NFκB）信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)通路激活，從而降低機(jī)體炎性水平，改善小鼠胰島素敏感水平和肝損傷程度。但是CIG對(duì)缺血再灌注小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的影響及ERK1/2信號(hào)通路的調(diào)控報(bào)道較少。因此，本研究于2019年3—6月對(duì)此進(jìn)行了初步研究，并探究其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實(shí)驗(yàn)材料及試劑18只清潔級(jí)雄性ICR小鼠由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，周齡5～6周，體質(zhì)量平均25 g，合格證號(hào)：SCXK（滬）20130024；CIG購(gòu)自中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；氯化三苯四氮唑（TTC）購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；ERK1/2，B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2），Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）擴(kuò)增序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、cDNA Reverse Transcription kit、RNAiso plus（D9108A）Trizol均購(gòu)自大連寶生物Takara公司；Bestar?Real time PCR Master Mix購(gòu)自德國(guó)DBI公司；抗磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）、Bcl-2、Bax抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，ERK1/2、GAPDH抗體購(gòu)自上海康成生物工程有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.1.2

實(shí)驗(yàn)儀器RM2235石蠟切片機(jī)購(gòu)自Leica公司；ABI7500fast熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Life technologies公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-rad公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自GE公司；線栓購(gòu)自廣州佳靈公司（線栓頭直徑0.18 mm）；CH-2 CX31熒光倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1

動(dòng)物模型制備及分組參照文獻(xiàn)采用大腦中動(dòng)脈栓塞法（MCAO）建立小鼠急性腦梗死模型。使用異氟烷麻醉小鼠后，暴露頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈近心端結(jié)扎，頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎，于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端插入線栓，進(jìn)線5 mm。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將18只清潔級(jí)雄性ICR小鼠分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組各6只。對(duì)照組小鼠不插入線栓，模型組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射150 mg/kgCIG，連續(xù)給藥7 d，每天給藥1次，7 d后再次對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)損傷評(píng)分。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2.2

小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》進(jìn)行小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分≥5分表明造模成功，剔除模型組及實(shí)驗(yàn)組造模評(píng)分＜5分的小鼠，評(píng)分越高代表小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.3

TTC染色法測(cè)定小鼠的腦梗死體積給藥7 d后對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉并處死，斷頭取出腦組織去掉嗅覺、小腦和低位腦干后，在海馬齒狀回平面連續(xù)冠狀切片，切成5組，每組約2 mm厚，置于2%的TTC溶液中避光染色，10%甲醛固定12 h，用圖像分析軟件計(jì)算梗死體積百分比，其中紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織。

1.2.4

TUNEL檢測(cè)測(cè)定腦梗死小鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡上述腦組織冠狀切片脫蠟、水化后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。染色后顯微鏡下觀察并記錄每個(gè)視野中細(xì)胞核被染成棕褐色和藍(lán)色的個(gè)數(shù)，每組記錄5個(gè)視野，計(jì)算平均凋亡率。其中細(xì)胞核被染為棕褐色的是凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核被染為藍(lán)色的是正常細(xì)胞。計(jì)算凋亡率=100%×凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）。

1.2.5

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)急性腦梗死小鼠腦組織ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量將小鼠梗死區(qū)腦組織消化離心后提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度并將其濃度調(diào)節(jié)為1 mg/L，經(jīng)37℃，30 min，85℃，30 s反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。cDNA用超純水稀釋后進(jìn)行定量PCR，PCR擴(kuò)增條件：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，31 s，40個(gè)循環(huán)，95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。以GAPDH作為參照，用2法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)急性腦梗死小鼠腦組織p-ERK1/2、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量將小鼠梗死區(qū)腦組織細(xì)胞裂解后，根據(jù)蛋白定量試劑盒提取總蛋白，測(cè)定總蛋白的濃度，取40 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用麗春紅染色后加入5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光試劑，曝光后采集圖像，計(jì)算各蛋白相對(duì)內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CIG對(duì)急性腦梗死小鼠神經(jīng)功能的影響

給藥前，對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為0分、（9.500±0.837）分、（9.667±0.516）分（

H=

12.793，

P

=0.002），模型組和實(shí)驗(yàn)組評(píng)分顯著高于對(duì)照組（

P

＜0.05），但是模型組和實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），說明造模成功。給藥后，對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為0分、（3.667±0.516）分、（2.333±0.516）分（

H=

15.395，

P

＜0.001），實(shí)驗(yàn)組評(píng)分顯著低于模型組（

P

＜0.05），說明CIG能明顯緩解腦梗死小鼠的神經(jīng)功能損傷。

2.2 CIG對(duì)急性腦梗死小鼠腦梗死體積的影響

給藥7 d后，對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組腦梗死小鼠腦梗死體積分別為0、（40.572±10.580）%、（22.795±

6.680

）%，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦梗死體積明顯小于模型組（

H=

13.008，

P

=0.001），說明CIG能明顯縮小腦梗死小鼠的腦梗死體積，見圖1。

2.3 CIG對(duì)急性腦梗死小鼠梗死區(qū)神經(jīng)元凋亡率的影響

對(duì)照組小鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞核基本未出現(xiàn)棕黃色，TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞很少，神經(jīng)元的凋亡率為（1.983±1.071）%；模型組小鼠腦組織中出現(xiàn)較多深褐色、形態(tài)不規(guī)則、大小不一的固縮核細(xì)胞，神經(jīng)元凋亡率為（79.678±7.203）%；實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中出現(xiàn)深染、固縮核細(xì)胞的數(shù)量明顯較模型組少，神經(jīng)元凋亡率為（49.171±10.914）%，明顯高于對(duì)照組（

P

＜0.05），少于模型組（

P

＜0.05），說明CIG可明顯減少腦梗死小鼠腦組織的神經(jīng)元凋亡。見圖2。

2.4 CIG對(duì)急性腦梗死小鼠腦組織凋亡相關(guān)因子Bcl

-

2、Bax表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果均顯示，三組小鼠腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均

P

＜0.001），實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組下調(diào)（

P

＜0.05），較模型組上調(diào)（

P

＜0.05）；Bax mRNA及其蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組上調(diào)（

P

＜0.05），較模型組下調(diào)（

P

＜0.05），說明CIG能明顯上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)。見圖3、表2。

圖3 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對(duì)急性腦梗死小鼠腦組織凋亡相關(guān)因子B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白表達(dá)的影響

表2 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對(duì)急性腦梗死小鼠B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）mRNA和蛋白表達(dá)的影響/±s

2.5 CIG對(duì)急性腦梗死小鼠ERK1/2表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠ERK1/2 mRNA表達(dá)量為（1.14±0.28），模型組小鼠ERK1/2 mRNA表達(dá)量為（1.21±0.12），實(shí)驗(yàn)組小鼠ERK1/2 mRNA表達(dá)量為（1.16±0.14），三組小鼠腦組織中ERK1/2 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F=

0.238，

P

=0.791）；蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，三組小鼠腦組織中ERK1/2蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

=0.633），實(shí)驗(yàn)組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組和模型組上調(diào)（

P

＜0.05），模型組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組上調(diào)（

P

＜0.05），說明CIG可促進(jìn)腦組織中ERK1/2的磷酸化，見圖4、表3。

表3 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對(duì)急性腦梗死小鼠ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響/±s

圖4 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對(duì)急性腦梗死小鼠p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腦梗死會(huì)造成缺血缺氧中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞迅速壞死，處于缺血半暗帶的細(xì)胞易受到氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及興奮性毒性等刺激，若未得到及時(shí)有效的治療，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，并產(chǎn)生不可逆的腦損傷。因此，減少缺血半暗帶尚未病變的神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為治療缺血性腦病的關(guān)鍵。CIG具有廣泛的生物活性，能夠抑制免疫作用、抗炎、抗血栓等。有研究發(fā)現(xiàn)，CIG的單體能降低大鼠腦缺血再灌注3d皮層梗死周邊區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，從而保護(hù)血腦屏障功能。Qu等研究發(fā)現(xiàn)，CIG可通過抑制Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)（JAK/STAT）通路抑制神經(jīng)炎癥和小角質(zhì)細(xì)胞活化，其可能是預(yù)防多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著低于模型組，腦梗死體積和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率顯著低于模型組。提示CIG可明顯改善小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡受多種因素調(diào)控，Bcl-2和Bax均是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，二者相互作用共同參與細(xì)胞的程序性凋亡過程。Bcl-2可與Bax蛋白形成多種二聚體，Bcl-2/Bcl-2、Bax/Bax、Bcl-2/Bax，而氧自由基及脂質(zhì)過氧化物的生成、Ca超載均與二聚體比例有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯較模型組上調(diào)，Bax mRNA及蛋白的表達(dá)明顯較模型組下調(diào)。提示了CIG可上調(diào)急性腦梗死小鼠Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

ERK1/2介導(dǎo)信號(hào)通路是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與神經(jīng)元的生存和死亡密切相關(guān)。ERK1/2被磷酸化激活后會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，參與某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡。Li的研究結(jié)果顯示，激活的ERK可降低N-甲基-D-天冬氨酸受體活性，抑制Ca內(nèi)流，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死后p-ERK1/2表達(dá)增加，采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMNCs）干預(yù)后，p-ERK1/2的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，結(jié)果提示BMMNCs能夠促進(jìn)ERK1/2的磷酸化水平，從而改善神經(jīng)功能，降低梗死范圍。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)印跡法均顯示，與對(duì)照組及模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是p-ERK1/2蛋白的水平明顯較對(duì)照組和模型組升高。提示了CIG能促進(jìn)急性腦梗死小鼠腦組織中ERK1/2的磷酸化。因此本研究推測(cè)CIG通過促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，使得細(xì)胞核ERK1/2被磷酸化為p-ERK1/2，并進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，CIG具有縮小腦梗死體積、減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用，通過抑制Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過調(diào)節(jié)ERK磷酸化實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)抗凋亡及促凋亡蛋白之間的平衡，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

注：圖2中箭頭表示凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞。