長鏈非編碼RNA母系表達基因8靶向微小RNA-497-5p調控血管瘤血管內皮細胞的增殖和凋亡

張蕾，林瑩波，喬娟，王云璐

作者單位：1河南中醫藥大學護理學院，河南鄭州450046；2廣東茂名健康職業學院，廣東茂名525000

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，通常發生在嬰兒出生時或出生后兩周，約75%～80%的血管瘤病人為女性。雖然血管瘤是一種良性腫瘤，但嚴重的血管瘤會影響皮膚的功能，給病人及其近親屬帶來沉重的身心負擔，部分血管瘤的快速生長和侵襲甚至威脅兒童的生命。因此，了解血管瘤發生發展的分子機制對于血管瘤的早期診斷和有效的聯合治療具有至關重要的作用。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸與腫瘤細胞的增殖、凋亡、擴散轉移以及血管生成有關的非編碼RNA。劉筱雯通過轉錄組芯片技術進行嬰幼兒血管瘤組織lncRNAs表達譜分析發現，lncRNA母系表達基因8（maternally expressed gene 8，MEG8）在血管瘤中表達上調，且通過定量聚合酶鏈反應（qPCR）驗證表達存在明顯差異。此外，有研究報道MEG8在轉化生長因子-β（TGF-β）誘導的肺癌A549細胞和胰腺癌Panc1細胞中表達上調，參與肺癌、胰腺癌細胞上皮間質轉化的表觀遺傳學進程。但目前MEG8在血管瘤發生發展中的作用尚不明確。因此，本研究分析了MEG8在血管瘤組織中的表達，研究MEG8對血管瘤內皮細胞增殖、凋亡的影響及其可能的分子機制，以期為MEG8作為血管瘤的診療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

血管瘤組織（52例，均為增殖期腫瘤組織）和與其對應的瘤旁正常皮膚組織（52例）由河南中醫藥大學第一附屬醫院于2017年1月至2018年6月間收集。52例樣本來源于嬰幼兒，其中男性15例，女性37例，年齡為3個月至12歲之間。在開展本研究之前所有病人近親屬均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。血管瘤血管內皮細胞HemEC細胞購于上海柯雷生物科技有限公司；EBM-2培養基購于Lonza公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；Lipofectamine2000購于Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；Trizol試劑和蛋白質印跡法（Western blotting）相關試劑購于上海碧云天生物技術有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；PCR引物、si-MEG8、si-NC、微小RNA（miR）-497-5p mimics、miR-NC、anti-miR-497-5p、anti-miR-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MEG8以 及WTMEG8、MUT-MEG8的構建和測序均由北京華大基因公司提供；兔源細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體、兔源P21單克隆抗體、兔源B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）單克隆抗體、兔源Bcl相關X（Bax）蛋白多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔Ⅱ抗均購于Abcam公司。

1.2 細胞培養、轉染和分組

用含有10%胎牛血清的EBM-2培養基培養HemEC細胞。培養箱環境條件是37℃，二氧化碳體積分數為5%，濕度90%。取對數生長期的HemEC細胞，按照每孔2×10個細胞的密度接種于6孔板，利用Lipofectamine2000分別將si-MEG8、si-NC、miR-497-5p mimics、miR-NC轉染至生長融合度為80%的HemEC細胞，并依次標記為si-MEG8組、si-NC組、miR-497-5p組、miR-NC組，培養24～72 h后，檢測轉染效果，進行后續實驗。為驗證MEG8能夠通過調控miR-497-5p表達，將antimiR-497-5p、anti-miR-NC分別和si-MEG8共轉染至HemEC細胞，并依次標記為anti-miR-497-5p組、anti-miR-NC組，培養24-72 h后，檢測HemEC細胞的增殖和凋亡情況。

1.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測MEG8和miR

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497

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5p的表達水平

利用Trizol法分別提取52例血管瘤組織和與其對相應的瘤旁正常皮膚組織，以及各組HemEC細胞的總RNA，紫外分光光度法測定其濃度后，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA），隨后進行qRT-PCR擴增。2法計算MEG8和miR-497-5p的相對表達水平。

1.4 雙熒光素酶報告基因驗證MEG8和miR

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497

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5p的靶向關系

利用生物信息軟件預測MEG8的靶基因。發現MEG8與miR-497-5p能夠特異性結合，猜測MEG8和miR-497-5p存在靶向調控關系，并利用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。利用Lipofectamine2000將miR-497-5p mimics和miR-NC分別與WT-MEG8和MUT-MEG8共轉染HemEC細胞，轉染48 h后，測定各組HemEC細胞的熒光素酶活性。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞活力

將對數期HemEC細胞按照2×10個/孔的密度接種于96孔板，按照“1.2”方法轉染后，分別于轉染后24 h、48 h、72 h時間點加入10 μL的質量分數為5 g/L的MTT試劑，孵育4 h后，棄去上清液，各孔再加入二甲基亞砜試劑150 μL，震蕩10 min至結晶充分溶解，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組對數期

HemEC細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞，離心棄上清液后，用適量的1×結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為1×10/mL。每管內加入100 μL細胞懸液，再向管中加入5 μL的膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），室溫避光輕輕地混勻10 min，加入5 μL的碘化丙啶（PI），室溫，避光孵育5 min，加入PBS至500 μL，輕輕混勻，在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.7 蛋白質印跡法檢測

利用RIPA裂解液裂解各組對數期HemEC細胞，獲得細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。取30 μg已變性的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳結束后，利用轉膜裝置將已分離的細胞蛋白轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉膜結束后，用Western封閉液室溫搖床封閉30 min，吸盡封閉液后，用Western洗滌液漂洗膜（共3次，10分鐘/次），然后加入已稀釋的抗cyclin D1（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶2 500）蛋白的Ⅰ抗，室溫孵育2 h后，向已洗滌后的PVDF膜中加入稀釋好的Ⅱ抗，孵育1 h，ECL發光試劑盒顯色后進行拍照，并用Image J軟件對目的條帶進行定量分析。

2 結果

2.1 MEG8和miR

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497

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5p在血管瘤組織和瘤旁正常皮膚組織中的表達

qRT-PCR檢測顯示，與瘤旁正常皮膚組織相比，血管瘤組織中MEG8的表達水平顯著升高［（0.33±0.03）比（0.82±0.08），

t

=41.356，

P

＜0.001］，miR-497-5p的表達水平顯著降低［（0.84±0.08）比（0.34±0.03），

t

=42.200，

P

＜0.001］。

2.2 抑制MEG8對細胞HemEC增殖的影響

如表1和圖1所示，與si-NC組比較，si-MEG8組HemEC細胞MEG8的表達水平降低（

P

＜0.05），表明成功構建抑制MEG8表達的HemEC細胞株。與si-NC組比較，si-MEG8組HemEC細胞cyclin D1蛋白的表達水平降低，P21蛋白的表達水平升高；細胞在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低（

P

＜0.05）。表明，抑制MEG8能夠抑制血管瘤血管內皮細胞增殖。

表1 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內皮細胞HemEC增殖的影響/±s

圖1 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內皮細胞HemEC增殖蛋白表達的影響

2.3 抑制MEG8對細胞HemEC凋亡的影響

如表2所示，與si-NC組相比，si-MEG8組HemEC細胞Bcl-2蛋白的表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）。表明，抑制MEG8能夠促進血管瘤血管內皮細胞凋亡。

表2 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

2.4 MEG8靶向調控miR

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497

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5p表達

利用生物學信息軟件在線進行靶基因預測顯示，見圖2，miR-497-5p和MEG8存在部分連續結合位點。與miRNC和WT-MEG8共轉染組相比，miR-497-5p和WTMEG8共轉染組HemEC細胞的熒光素酶活性降低［（0.37±0.04）比（1.05±0.10），

t

=15.465，

P

＜0.001］；與miR-NC和MUT-MEG8共轉 染組 相比，miR-497-5p和WT-MEG8共轉染組HemEC細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義［（1.07±0.10）比（1.08±0.10），

t

=0.173，

P

=0.866］。pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG8組、si-NC組、si-MEG8組四組比較，

F

=195.212，

P

＜0.001。pcDNA3.1-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p表達水平低于pcDNA3.1組［（0.09±0.01）比（0.38±0.05），

P

＜0.05］；si-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p表達水平高于si-NC組［（0.88±0.09）比（0.39±0.05），

P

＜0.05］。以上結果表明，miR-497-5p是MEG8的靶基因，MEG8可負性調控miR-497-5p的表達。

圖2 生物學信息軟件在線預測母系表達基因8（MEG8）與miR-497-5p結合位點

2.5 過表達miR

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497

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5p對細胞HemEC增殖、凋亡的影響

如表3，4所示，與miR-NC組比較，miR-497-5p組HemEC細胞miR-497-5p的表達水平上調（

P

＜0.05），表明已成功構建過表達miR-497-5p的HemEC細胞株。與miR-NC組比較，miR-497-5p組HemEC細胞cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平降低，P21和Bax蛋白的表達水平升高（

P

＜0.05）；細胞在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）。表明，過表達miR-497-5p能夠抑制血管瘤血管內皮細胞增殖，促進細胞凋亡。

表3 過表達miR-497-5p對血管瘤血管內皮細胞HemEC增殖的影響/±s

表4 過表達miR-497-5p對血管瘤血管內皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

2.6抑制miR

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497

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5p能逆轉抑制MEG8對細胞HemEC增殖、凋亡的作用

如表5，6所示，與si-NC組相比，si-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平降低，P21和Bax蛋白的表達水平升高，在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）；與si-MEG8+anti-miR-NC組 相 比，si-MEG8+anti-miR-497-5p組HemEC細胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平升高，P21和Bax蛋白的表達水平降低，在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率增加，細胞凋亡率下降（

P

＜0.05）。以上結果表明，抑制miR-497-5p表達能夠逆轉抑制MEG8對血管瘤血管內皮細胞增殖和凋亡的影響。

表5 抑制miR-497-5p能逆轉抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內皮細胞HemEC增殖的影響/±s

3 討論

近年來，lncRNA在血管瘤的發生發展中的作用受到越來越多研究者的關注。馬從乾等研究發現，LINC00152在血管瘤組織中的表達明顯上調，LINC00152可通過促進血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）表達促進血管瘤內皮細胞的增殖、遷移和侵襲；Zhao等研究表明，核內小RNA宿主基因16（SNHG16）在血管瘤組織中呈高表達，SNHG16通過調控miR-520d-3p/信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）軸，作為細胞增殖、血管形成、遷移和侵襲的競爭性內源RNA；Zhang等報道沉默尿路上皮癌相關1（UCA1）通過上調miR-200c表達抑制血管瘤內皮細胞存活，誘導細胞凋亡，進而抑制血管瘤生長；此外，腫瘤易感性候選基因9（CASC9）和opa相互作用蛋白5反義轉錄本1（OIP5-AS1）也參與對血管瘤細胞的增殖和轉移的調控。以上研究提示，lncRNA在血管瘤的進展中發揮至關重要的作用，探索與血管瘤相關的lncRNA，對血管瘤病人的精準治療具有重大意義。

MEG8基因定位于人14號染色體和鼠12號染色體，是最早在小鼠中鑒定的印記基因。其與父系表達基因Dlk1和Dio3以及若干母系表達基因Gtl2、Meg3、Mirg等構成Dlk1-Dio3印記區域，參與調控肌肉形成和胚胎發育。目前，關于MEG8基因在腫瘤的研究還比較少，僅發現MEG8在TGF-β誘導的肺癌A549細胞和胰腺癌Panc1細胞中表達上調，MEG8通過與EZH2蛋白增強子結合，誘導其募集到miR-34a和miR-203的調節區域，促進H3甲基化，抑制轉錄。然而，其人類同系物Meg3基因在腫瘤中的作用被廣泛報道。例如，在宮頸癌中，Meg3表達下調，過表達Meg3通過靶向miR-21-5p可抑制宮頸癌腫瘤的生長，促進腫瘤細胞凋亡；在胃癌中，Meg3也呈低表達，過表達Meg3通過調控p53信號通路可抑制胃癌細胞的增殖和轉移；此外，Meg3還可發揮內源性miR-494分子海綿作用調控PTEN/PI3K/AKT通路抑制血管瘤的發生。本研究發現，MEG8在血管瘤組織中表達上調，抑制MEG8能夠抑制血管瘤內皮細胞增殖，促進細胞凋亡。表明，MEG8在血管瘤中發揮癌基因作用。

表6 抑制miR-497-5p能逆轉抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

為探索MEG8調控血管瘤發生的分子機制，利用生物信息學軟件在線進行靶基因預測發現，miR-497-5p是MEG8的潛在靶基因。miR-497-5p是一種抑癌基因，研究發現，miR-497-5p在非小細胞肺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中表達下調，過表達miR-497-5p能夠抑制腫瘤細胞增殖和侵襲能力。本研究結果顯示，miR-497-5p在血管瘤組織中表達水平顯著下調。同時通過雙熒光素酶報告基因實驗和蛋白質印跡法檢測證實MEG8可靶向負性調控miR-497-5p表達，進一步研究發現，過表達miR-497-5p能夠抑制cyclin D1和Bcl-2蛋白表達，促進P21和Bax蛋白表達，抑制血管瘤內皮細胞增殖，促進細胞凋亡。為進一步證實MEG8通過調控miR-497-5p表達參與對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的調控，將si-MEG8和anti-miR-497-5p共轉染至血管瘤內皮細胞，發現抑制miR-497-5p表達能夠逆轉抑制MEG8對血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的影響。提示MEG8通過靶向調控miR-497-5p表達促進血管瘤的發生發展。

綜上所述，lncRNA MEG8在血管瘤組織中表達顯著上調，miR-497-5p表達下調，抑制MEG8通過靶向miR-497-5p能夠抑制血管瘤內皮細胞增殖，誘導細胞凋亡，MEG8有望成為血管瘤分子治療的新靶點。