過表達亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1對胰腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響

李強，張翠翠

作者單位：1棗莊市立醫院消化內科，山東 棗莊277100；2棗莊礦業集團棗莊醫院消化內科，山東 棗莊277100

胰腺癌是一種具有較強侵襲能力的消化道腫瘤，近年來的發病率呈顯著上升趨勢。據統計，胰腺癌在2030年將成為導致人類死亡率增加的主要原因。胰腺癌預后較差。據報道，胰腺癌的5年生存率約為5%，大多數病人由于發生轉移而失去手術根治的機會，同時具有較高的復發率；放療和化療易產生細胞放療或化療抵抗性，從而降低腫瘤治療效果。胰腺癌的發生發展過程中受到多種基因多階段精細調控，其發病機制尚不能完全明確。近年來，分子靶向具有特異性高、副作用小等特點成為腫瘤臨床治療研究的重點和熱點。研究發現，亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（leucinezipper putative tumor suppressor1，LZTS1）在多種腫瘤組織中表達量缺失，抑制腫瘤的發生發展。在胰腺癌中，研究結果顯示LZTS1的表達量顯著降低，但其在胰腺癌中的具體作用機制尚不清楚。因此，本研究從2018年5—12月開展實驗，探討過表達LZTS1對胰腺癌PANC-1生物學特性的影響，旨在為臨床分子靶向治療胰腺癌提供實驗依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PANC-1細胞購自北納生物有限公司，胎牛血清、Lipofectamine 2000、DMEM培養基、Trizol試劑購自美國Sigma公司，細胞凋亡試劑盒、噻唑藍（MTT）購自北京索萊寶公司；pcDNA3.0 LZTS1-1、pcDNA 3.0 LZTS1-2以及陰性對照購自廣州銳博有限公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Coring公司，兔抗LZTS1抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Abcam公司。酶標儀、流式細胞儀購自美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1

細胞的培養PANC-1細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，顯微鏡觀察到細胞密度約80%～90%，加入胰酶消化、傳代。

1.2.2

細胞的轉染取對數期PANC-1細胞，按隨機數字表法分為四組，即對照組（常規培養）、NC組（轉染陰性對照）、pcDNA-LZTS1-1組（轉染pcDNA 3.0 LZTS1-1質粒）、pcDNA-LZTS1-2組（轉染pcDNA 3.0 LZTS1-2質粒）。轉染前24 h，胰酶消化、計數，收集5×10個PANC-1細胞接種至6孔板。根據Lipofectamine 2000說明書指示，分別稀釋Lipofectamine 2000和質粒，將兩稀釋液晃動混勻，吸取100 μL加入每孔細胞，37℃培養4～6 h，更換為完全培養基。

1.2.3

蛋白質印跡法（Western blotting）收集轉染后的PANC-1細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白。將所提取的總蛋白與適量上樣緩沖液混勻，沸水變性10 min；提前配置8%～10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。將電泳的目的條帶轉移至聚偏二氟乙烯膜；轉膜完，置于5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；加入一抗，LZTS1 1∶5 000，GAPDH 1∶10 000，4℃孵育過夜，洗膜緩沖液漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育2 h，洗膜緩沖液漂洗3次×10 min，暗室中加入化學發光工作液孵育5 min，曝光、拍照，分析LZTS1蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.2.4

MTT法吸取5×10個各組PANC-1細胞接種至96孔板上，置于細胞培養箱中培養，分別在細胞培養24 h、48 h、72 h時，加入10 μL MTT溶液（0.5% MTT），37℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亞砜，酶標儀中檢測570 nm PANC-1細胞吸光度。

1.2.5

流式細胞術實驗根據凋亡檢測試劑盒的說明書，將對數期PANC-1細胞密度調整為1×10個/毫升，加入10 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10～15 min，上機檢測。

1.2.6

Transwell實驗將適量Matrigel膠與300 μL無血清培養基混勻；侵襲實驗前，吸取100 μL Matrigel膠稀釋液加入Transwell上室膜，37℃孵育5 h，但遷移實驗Transwell上室膜不添加Matrigel膠，其實驗方法同侵襲實驗。收集各組5×10個PANC-1細胞加入上室，500 μL含10%胎牛血清的培養基加入Transwell下室，37℃孵育24 h；磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）清洗上室，擦去殘留PANC-1細胞，拍照、計數。

2 結果

2.1 轉染pcDNA

-

LZTS1對LZTS1表達量的影響

PANC-1細 胞 中 轉 染pcDNA 3.0 LZTS1-1和pcDNA 3.0 LZTS1-2質粒，蛋白質印跡法檢測轉染效果。結果如圖1所示，四組LZTS1的表達量比較差異有統計學意義（

F

=107.509，

P

＜0.05）。與對照組（1.000±0.085）相比，NC組PANC-1細胞中LZTS1的表達量（1.025±0.107）未發生顯著變化（

P=

0.591）；pcDNA-LZTS1-1組（2.835±0.301）和pcDNA-LZTS1-2組（4.125±0.385）細胞中LZTS1的表達量較對照組明顯增加（均

P

＜0.001）；其中pcDNA-LZTS1-2對細胞中LZTS1表達量的促進作用高于pcDNA-LZTS1-1，因此后續選用pcDNA-LZTS1-2作為實驗對象。

圖1 轉染pcDNA-LZTS1對人胰腺癌PANC-1細胞亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）表達量的影響

2.2 過表達LZTS1對PANC

-

1細胞增殖的影響

MTT法檢測過表達LZTS1對PANC-1細胞增殖的影響，結果如表1所示，與對照組相比，NC組PANC-1細胞增殖未發生明顯變化（均

P

＞0.05）；pcDNA-LZTS1-2組細胞增殖較對照組明顯降低（均

P

＜0.05）。

表1 過表達亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響/±s

2.3 過表達LZTS1對PANC

-

1細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測過表達LZTS1對PANC-1細胞凋亡的影響，結果顯示，三組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（

F

=143.933，

P

＜0.05）。與對照組（6.589±0.645）%相比，NC組PANC-1細胞凋亡率（7.352±0.698）%無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNA-LZTS1-2組（23.252±2.152）%明顯增加（

P

＜0.05）。

2.4 過表達LZTS1對PANC

-

1細胞遷移的影響

Transwell法實驗檢測過表達LZTS1對PANC-1細胞遷移的影響，結果顯示，三組遷移細胞數比較差異有 統計學 意義（

F

=30.167，

P

＜0.05）。與對照 組（233.258±25.148）個 相 比，NC組 遷 移 細 胞 數（252.321±26.241）個無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2組（120.145±14.210）個 降 低（

P

＜0.05）。見圖2。

2.5 過表達LZTS1對PANC

-

1細胞侵襲的影響

Transwell法實驗檢測過表達LZTS1對PANC-1細胞侵襲的影響，結果顯示，三組侵襲細胞數比較差異有 統計學 意義（

F

=35.735，

P

＜0.05）。與對照 組（117.258±12.152）個 相 比，NC組 侵 襲 細 胞 數（121.362±12.025）個無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2組（56.369±6.432）個 降 低（

P

＜0.05）。見圖2。

圖2 過表達亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）對人胰腺癌PANC-1細胞遷移和侵襲的影響（結晶紫染色×200）

3 討論

胰腺癌是一種嚴重危害人類身體健康的惡性腫瘤，給病人、社會帶來了嚴重的經濟負擔。近年來，隨著生物領域的不斷發展，胰腺癌的臨床治療具有了顯著的發展，探究新的基因標志物有助于腫瘤演進機制的闡釋，還可以為胰腺癌的早期診斷、分子靶向治療提供潛在位點。LZTS1是近年來發現的新型抑癌基因，在正常組織中表達，但在多種腫瘤組織中表達量顯著降低，抑制腫瘤的發生發展過程。與鄰近正常結腸組織相比，LZTS1在結腸癌中表達量降低，且其表達量與病人的預后生存率相關；過表達LZTS1抑制結直腸癌細胞的增殖，敲低LZTS1促進細胞的增殖，在結直腸癌的腫瘤生長過程中發揮抑制作用，可作為結直腸癌病人的潛在預后指標。免疫組化檢測LZTS1在乳腺癌組織中的表達量，結果顯示，LZTS1表達量較對照顯著下降，與淋巴結轉移相關，表明LZTS1可能參與乳腺癌轉移過程。另外，LZTS1在甲狀腺癌、肝癌、乳腺癌等表達量均異常，提示LZTS1在多種腫瘤生長過程中發揮重要的作用。

當機體發生病理變化時，組織中的細胞增殖與凋亡動態平衡被打破，從而影響機體的組織功能，誘導疾病的產生。在腫瘤的發生發展過程中，細胞侵襲、遷移能力的提高可促進腫瘤組織的進一步轉移，嚴重影響病人的預后，提高復發率。為探究LZTS1在胰腺癌發生發展中的具體作用，本實驗通過在胰腺癌PANC-1細胞中轉入過表達LZTS1的質粒pcDNA 3.0 LZTS1-1或pcDNA 3.0 LZTS1-2（攜帶不同的寡核苷酸序列），結果發現，pcDNA 3.0 LZTS1-2質粒較pcDNA 3.0 LZTS1-1質粒具有較好的促進LZTS1表達的效果，因此后續實驗選取pcDNA 3.0 LZTS1-2質粒作為實驗對象。MTT法和流式細胞術實驗觀察過表達LZTS1表達量對細胞增殖、凋亡的影響，結果顯示，過表達LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖，促進凋亡；進一步通過Transwell檢測發現，過表達LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞侵襲、遷移，表明LZTS1通過抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學特性，誘導腫瘤細胞凋亡，從而阻礙胰腺癌的發生發展，與結直腸癌、乳腺癌等結果相似，均發揮抑癌作用。研究發現，LZTS1可通過調控Akt-mTOR、PI3K/Akt等信號通路抑制腫瘤細胞增殖，進 一 步 提 示LZTS1在胰腺癌中也可能通過調控細胞增殖相關的信號通路，從而參與腫瘤的發生發展，但其具體的作用機制尚需進一步的研究。

綜上所述，過表達LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移、侵襲能力，促進其凋亡，在胰腺癌腫瘤發生發展過程中發揮抑制作用，為胰腺癌的臨床治療提供潛在的基因標志物，但本研究只在細胞水平研究了LZTS1的腫瘤抑制作用，未來會深入研究LZTS1發揮腫瘤抑制作用的具體分子機制以及與相關信號通路的作用，并在多株胰腺癌細胞以及動物模型中開展LZTS1的相關研究。