生物有機肥替代化肥對小麥根際土壤環境的影響

王俊紅，王星琳，2，王 康 ，任振興 ，王夢亮

(1.山西大學 應用化學研究所，山西 太原 030006；2.山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006)

20世紀80年代至今，我國糧食產量增加73%，同時化肥用量增加476%，農業生產所用氮肥利用率僅為30%左右[1]。傳統農業對化肥的過度依賴，破壞了土壤養分平衡與微生物群落的穩定[2]，嚴重威脅著資源與環境安全，不利于農業可持續發展。生物有機肥是肥菌兼具的新一代微生物肥料，憑借其綠色安全、節約資源的優勢成為我國農業綠色、可持續發展的突破口[3]。有研究表明[4-5]，生物有機肥替代部分化肥，有利于改善土壤養分循環、增加土壤酶活性、提高作物產量與品質。劉雷等[6]研究發現，增施生物有機肥顯著提高了根際土壤酶的活性，改善了土壤肥力水平。此外，生物有機肥中含有的大量促生菌，在促進根系生長，增強作物抗病、抗逆性方面發揮不可替代的作用[7-8]。Chen等[9]研究發現，生物有機肥使土壤微生物多樣性與豐富度升高，土壤養分循環與有機質的代謝更加旺盛，顯示出更高的生產力以及更強的抗病、抗逆性[10]。陸海飛等[11]研究發現，配施生物有機肥后，土壤細菌群落多樣性與豐富度指數顯著增加。因此，通過生物有機肥調控土壤微生物群落結構與活動，在保證產量的基礎上，減少化肥的施用，對于解決過量施肥帶來的環境污染問題、實現“綠色農業”具有重要的意義[12]。

小麥是我國重要的糧食作物，保障其產量持續穩定地增加，關乎國家的糧食安全。將生物有機肥應用于麥田土壤，利用其可改善土壤養分循環、調節根際微生物區系、提高產量與品質，探索生物有機肥替代部分化肥的科學比例與用量，對于促進我國農業經濟發展具有重要意義。目前，關于生物有機肥替代部分化肥對小麥產量構成、生育期內酶活影響的報道較多，但是通過高通量測序技術，研究生物有機肥對小麥根際微生物群落結構調控機制尚不多見。

本試驗以大田小麥為研究對象，探索生物有機肥替代部分化肥對小麥根際土壤養分、酶活、土壤細菌群落結構的影響，并通過冗余分析研究上述環境因子與細菌群落結構的相關性，旨在為改良傳統施肥模式，促進化肥的減量增效，推進生物有機肥規?；瘧锰峁├碚撝С?。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于山西省臨汾市洪洞縣秦壁村(36°13′40.03″N，111°42′1.85″E)，平均海拔為530 m，屬溫帶季風氣候，年平均溫度12.3 ℃，年平均降水量493.3 mm，土壤類型為褐土。

1.2 試驗材料

供試小麥品種為莘麥818，由山東莘州種業有限公司育種；供試化肥為復合肥料(N∶P2O5∶K2O=25∶14∶6)；供試生物有機肥的有機質含量≥45%，功能菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(有效活菌數≥1.0×109cfu/g)，由太原山大新科技發展有限公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 試驗于2019年10月9日至2020年6月10日進行，采用隨機區組設計，共設4個處理，每個處理3次重復。小區面積50.0 m2(25.0 m×2.0 m)。試驗設計方案見表1。

表1 試驗設計方案Tab.1 Design of experimental treatment

1.3.2 樣品采集與處理 2020年4月18日，在小麥的拔節期采集土壤樣品。采用五點取樣法，去除表層浮土后，收集0～20 cm小麥根際部位土樣，混合均勻，其中一部分土樣自然風干后過0.2 mm篩，用于后續土壤養分含量的測定；另一部分土壤樣品在4 ℃環境下保存，用于土壤酶活的測定和土壤DNA的提取。

1.3.3 土壤細菌 總DNA提取與PCR擴增使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio)試劑盒提取土壤總DNA；采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的大小與完整性，采用Nanodrop 2000檢測提取DNA的純度。

采用通用引物338F對細菌16S rRNA的V3～V4區進行特異性擴增，在338F的3′端添加特異的Barcode序列區分樣品。PCR反應體系為25 μL；反應條件為：98 ℃預變性 2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環；72 ℃延伸5 min，反應結束，產物混勻后通過2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產物進行純化，回收目標片段，按照各樣本測序的需用量，將各產物等摩爾數混合。文庫的構建與高通量測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成，測序平臺為Illumina MiSeq平臺。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 土壤養分含量 土壤有機質(SOM)含量測定采用低溫外熱重鉻酸鉀比色法；全氮(TN)含量測定采用凱氏定氮法；速效磷(AP)含量測定采用鉬銻抗比色法；速效鉀(AK)含量測定采用火焰分光光度計法[13]。

1.4.2 土壤酶活測定 土壤脲酶(Solid-Urease，S-UE)活性測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法；蔗糖酶(Solid-Sucrase，S-SC)活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法；中性磷酸酶(Soild-neutral-phosphatase，S-NP)活性測定采用磷酸苯二鈉比色法。所用土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.4.3 小麥產量的測定 于6月10日在小麥收獲期測定小麥產量。各處理隨機選取3個1 m2的樣點，對小麥株高、穗粒數、千粒質量和產量進行統計。

1.5 數據處理與統計分析

測序結果首先運用Qiimev1.8.0軟件識別疑問序列，調用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列，獲得Effective Tags；隨后采用序列比對軟件UCLUSTv5.2.236對得到的Effective Tags按照97%的相似度進行OTU聚類[14]，并選取其中出現頻率最高的序列作為代表序列，最終通過數據庫分析確定各OTU對應的分類水平[15]。

數據處理與統計分析采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0 軟件進行，采用Canoco for Windows 5.0軟件對土壤養分、酶活和細菌群落結構的相關性進行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

2 結果與分析

2.1 不同處理對根際土壤養分含量的影響

土壤養分含量反映土壤的肥力水平，直接影響作物的生長狀況。由表2可知，CK處理SOM、AP和AK養分含量均為最低；與NPK處理相比，生物有機肥替代部分化肥(MNPK、MDNPK)提高了根際土壤有機質、總氮、速效磷、速效鉀含量，其中，化肥減量10%+生物有機肥(MNPK)處理有機質、總氮、速效磷、速效鉀含量均最高，較NPK處理分別增加17.4%，12.4%，16.2%，19.2%。

表2 不同處理對小麥根際土壤養分含量的影響Tab.2 Effects of different treatments on the nutrient content of wheat rhizosphere soil

2.2 不同處理對根際土壤酶活的影響

脲酶是促進土壤氮素循環的關鍵酶，可以增加土壤中銨態氮的含量，促進植物根系對氮素的吸收利用[16]。蔗糖酶又稱轉化酶，參與土壤碳素循環過程，與土壤中有機質含量和根際微生物豐富度、多樣性密切相關[17]。磷酸酶是一種水解性酶，能促進土壤脫磷，提高土壤中有效磷的含量。由表3可知，CK處理的土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性均為最低；與NPK相比，生物有機肥替代部分化肥(MNPK、MDNPK)處理提高了土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性，其中，MNPK處理S-UE與S-SC活性較NPK處理分別顯著升高19.0%和9.7%(P<0.05)；MNPK和MDNPK處理，S-NP活性較NPK處理分別顯著升高18.3%，21.2%(P<0.05)，但MNPK和MDNPK處理間差異不顯著。結果表明，MNPK處理顯著增加了土壤中S-UE、S-SC、S-NP的活性，與土壤養分含量結果變化一致。

表3 不同處理對小麥根際土壤酶活影響Tab.3 Effects of different treatments on soil enzyme activities in wheat rhizosphere mg/g

2.3 測序結果分析

16S rRNA高通量測序得到的初始序列經質量篩查后，共得到642 180條有效序列，基于97%的相似性進行歸并與劃分，一共得到12 452個OTU，分別屬于29門93綱190目293科528屬。通過對不同處理細菌群落OTU變化的Venn圖分析，結果發現(圖1)，CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個處理分別得到5 990，5 942，6 034，5 690個OTU；4個處理共有的OTU數有2 073個；特有的OTU數分別為1 640，2 089，1 577，1 460個，其中，NPK處理中特有的OTU數占總OTU數的51.3%，說明僅施化肥會使小麥根際土壤細菌群落OTU數發生顯著變化。

Chao1指數和ACE指數用于評價群落豐富度，其中，Chao1指數用于估計群落樣本中的OTU數，能更好地評價低豐度物種的分布狀況，ACE指數用來估計群落樣本中的OTU數，體現了某一OTU在樣本中出現的概率；Shannon指數和Simpson指數用于評價群落多樣性與均勻度。由表4可知，NPK處理Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數均為最低，其中，NPK處理的Chao1指數和ACE指數顯著低于MNPK與MDNPK處理。說明只施化肥顯著降低了土壤細菌群落豐富度，生物有機肥替代部分化肥有助于恢復土壤細菌群落多樣性與豐富度。

圖1 不同處理土壤細菌群落OTU Venn圖Fig.1 Venn diagram of soil bacterial community OTUs in soil samples from different treatments

表4 不同處理土壤細菌多樣性指數統計Tab.4 Diversity indices statistical results of soil bacterial communities in different treatments

2.4 不同分類水平上的物種注釋及分析

2.4.1 基于細菌門水平上群落結構變化 各處理門水平上細菌群落結構如圖2所示，在相對豐度前10的門中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)為優勢菌門，在CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個處理中，變形菌門的豐度最高，占29.7%～36.0%；放線菌門占15.4%～17.8%；酸桿菌門占14.6%～19.0%，綠彎菌門占11.4%～12.3%；芽單胞菌門占6.7%～10.9%。在CK、NPK、MNPK、MDNPK這4個處理中，5個優勢菌門的豐度分別為86.0%，86.9%，87.2%，85.1%，無顯著差異。擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、髕骨細菌門(Patescibacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等其他菌門豐度較低，為劣勢菌門。與NPK處理相比，MNPK與MDNPK處理的變形菌門豐度顯著升高(P<0.05)，MNPK處理的芽單胞菌門豐度顯著升高(P<0.05)，其余菌門豐度并無顯著變化。結果表明，生物有機肥替代部分化肥使變性菌門、芽單胞菌門這些功能菌門豐度升高，且能夠平衡根際土壤中優勢菌門的豐度。

2.4.2 基于細菌屬水平上群落結構變化 由圖3可知，不同處理間細菌群落組成及分布相似，選取豐度前20菌屬進行分析，相對豐度>1%的一共有11個菌屬。與CK處理相比，MNPK處理豐度升高的有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、水沉積物桿菌屬(Ilumatobacter)、溶桿菌屬(Lysobacter)、藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)、野野村菌屬(Nonomuraea)、Iamia、馬賽菌屬(Massilia)等7個菌屬；赭黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、MND1、RB41、Subgroup_10這4個菌屬豐度降低，其中，Subgroup_10豐度顯著降低(P<0.05)。與CK處理相比，MDNPK處理豐度升高的有鞘氨醇單胞菌屬、水沉積物桿菌屬、溶桿菌屬、馬賽菌屬、藤黃色單胞菌屬這5個菌屬，其中，鞘氨醇單胞菌屬豐度顯著升高(P<0.05)；MND1、野野村氏菌zamia、RB41、Iamia、Subgroup_10、赭黃嗜鹽囊菌屬這6個菌屬豐度降低，其中，赭黃嗜鹽囊菌屬豐度顯著降低(P<0.05)。結果表明，生物有機肥部分替代化肥使小麥根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬、水沉積物桿菌屬、溶桿菌屬、馬賽菌屬豐度升高，赭黃嗜鹽囊菌屬、Subgroup_10豐度降低，但不會影響優勢菌屬的種類。

圖2 不同處理對細菌門水平相對豐度的影響Fig.2 Effects of different treatments on the relative abundance of the bacterial phyla

圖3 不同處理對細菌屬水平相對豐度的影響Fig.3 Effects of different treatments on the relative abundance of the bacterial genera

2.5 土壤細菌群落結構與環境因子的關系

有研究表明，不同的環境因子會影響土壤細菌的群落結構[18-19]。本研究采用冗余分析研究土壤養分含量、酶活對屬水平上細菌群落結構的影響，由圖4可知，土壤養分與酶活一共解釋了77.9%的細菌群落結構變化，第1軸與第2軸分別解釋了響應變量的51.8%和16.1%。進一步分析發現，S-NP(P=0.034)和S-SC(P=0.016)是影響細菌群落結構的主要因子；S-NP、S-SC、TN與鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、交替紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬的豐度正相關，與RB41豐度負相關；S-UE、SOM、AP、AK與水沉積物桿菌屬、野野村菌屬、Iamia、馬賽菌屬、德沃斯氏菌屬、新根瘤菌屬、Bryobacter豐度正相關，與MND1、Subgroup_10、赭黃嗜鹽囊菌屬豐度負相關。

圖4 屬水平上細菌相對豐度與土壤養分含量、酶活的冗余分析(RDA)Fig.4 Redundancy analysis (RDA)among the relative abundance of the bacterial genera，soil nutrient content and enzyme activities

2.6 不同處理對小麥產量的影響

由表5可知，與單施化肥處理(NPK)相比，生物有機肥替代部分化肥處理對小麥株高、穗粒數和千粒質量等農藝性狀均沒有顯著影響，與NPK處理相比，MNPK與MDNPK處理小麥產量顯著提高9.3%，4.4%(P<0.05)。與單施化肥相比，生物有機肥替代部分化肥處理可以保證小麥產量。

3 結論與討論

3.1 生物有機肥替代部分化肥對根際土壤養分與酶活的影響

植物根際是植物根系、土壤、微生物相互作用的一個微區域。土壤酶活性反映土壤微生物的活性，能更迅速反映不同施肥處理對土壤養分水平的影響[20]，在土壤有機質分解與其他養分循環過程中發揮著重要作用[21-22]。土壤養分含量與土壤酶活共同反映土壤的肥力與功能水平，直接影響作物的生長狀況，是評價土壤健康水平的重要指標。

表5 不同處理對小麥農藝性狀及產量的影響Tab.5 Effects of different treatments on agronomic trait and yield of wheat

本研究結果表明，與NPK處理相比，MNPK與MDNPK處理后，小麥根際土壤養分SOM、TN、AP、AK含量與土壤酶S-UE、S-SC、S-NP活性均有增加的趨勢，且MNPK處理效果最佳，說明化肥與生物有機肥合理組合，能夠顯著提高土壤養分含量與酶活水平。生物有機肥中含有大量有機質與豐富養分，能改善根際微環境，促進土壤養分的循環與積累，使土壤養分更加均衡，根系能更充分利用土壤養分，有助于土壤酶活性升高[23]。因此，生物有機肥替代部分化肥提高了土壤養分SOM、TN、AP、AK的含量以及土壤S-UE、S-SC、S-N活性，這與文獻報道[24-25]的結果相一致。

3.2 生物有機肥替代部分化肥對根際土壤細菌群落的影響

生物有機肥中含有大量促生菌，根際促生菌是土壤微環境的重要組成部分，參與到有機質的分解、養分的轉化等一系列土壤生物代謝過程，能降低過量施肥造成的生態退化，幫助修復土壤微生態，抑制土壤傳播疾病。本試驗對小麥根際土壤細菌群落進行高通量測序發現，生物有機肥替代部分化肥后土壤中變形菌門豐度明顯升高，放線菌門豐度降低。變形菌門是一類具有固氮作用的功能微生物，其豐度升高，有利于土壤中氮素的積累和轉化利用[26-27]，放線菌門適宜生活于有機質含量較低的環境中，肥料中有機質的輸入導致放線菌門豐度降低；相反酸桿菌門、擬桿菌門適宜于生活在養分含量高的環境中，故二者豐度呈現增加的趨勢[28-29]。根際土壤中富集了鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、硝化螺菌屬、馬賽菌屬等一些具有促生和生防作用的功能菌屬，其中，硝化螺菌屬是一類硝化細菌，將土壤中的亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，供植物吸收利用；馬賽菌屬會定殖在植物根上[30]，產生IAA和嗜鐵素，從而促進植物生長[31-32]。

RDA分析顯示，S-SC與S-NP活性是引起細菌群落結構變化的主要因素。生物有機肥替代部分化肥后，S-SC與S-NP活性與鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、交替赤桿菌屬、硝化螺菌屬正相關，AK含量與水沉積物桿菌屬、馬賽菌屬、新根瘤菌屬呈正相關，這與Cheng等[33]的研究結果基本一致。結果表明，生物有機肥替代部分化肥能提高土壤養分有效性和酶活性，增強作物根際效應，定向富集具有生物防治與促生作用的功能微生物菌群，最終促進作物產量的提高。

目前，過量施肥導致化肥利用率過低，土壤養分結構與菌群多樣性失衡等問題急需解決，通過調整傳統“大水大肥”的施肥模式，探索適宜的生物有機肥替代化肥比例，可為解決該問題提供新的思路。本研究發現，生物有機肥替代10%化肥與常規施肥相比，小麥產量顯著增加，但考慮到細菌群落組成與功能之間的復雜關系，短期施肥可能不足以使細菌群落結構發生穩定的差異，需要進行長期定位試驗。后續關于小麥在不同土壤環境下，生物有機肥替代化肥最適比例仍有待進一步研究。