與瓜類褪綠黃化病毒P22蛋白互作的寄主因子的篩選

陳思宇，楊 雪，楊靈玲，燕照玲，韓曉玉，李慶倫，李洪連，陳琳琳，孫炳劍，施 艷

(1.河南農業大學 植物保護學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農業科學院 農業經濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbitchloroticyellowsvirus，CCYV)主要通過煙粉虱(Bemisiatabaci)以半持久性方式進行傳播，侵染黃瓜、甜瓜等瓜類作物引起葉片褪綠和黃化，但是葉脈仍然保持綠色，嚴重時整株植物葉片變黃，已經成為制約瓜類作物產量和品質的重要病原[1-2]。日本最先報道該病害的發生[2]。我國于2011年首次報道了該病害的發生[3]。近年來該病害在我國迅速蔓延，目前在江蘇、浙江、上海、臺灣、新疆、湖南、山東、北京、海南、廣西、河南、河北等地區都有發生[4-8]。

CCYV屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)。基因組由2條正單鏈RNA組成，RNA1長度為8 607 nt，編碼4個閱讀框，分別為甲基轉移酶(MTR)和RNA解旋酶(Hel)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)、P1-6和P22；RNA2長度為8 041 nt，編碼8個閱讀框，分別為P4.9、Hsp70、P2-6、P59、P9、CP、CPm和P26[2]。

CCYV P22蛋白位于CCYV RNA1 3′末端，分子質量為22 ku。Chen等[9]研究證明了P22作為CCYV編碼的沉默抑制子發揮作用。已有研究表明，CCYV P22蛋白與黃瓜SKP1LB1蛋白互作，并且確定了F-box like基序(-LKLLI-)是P22發揮沉默抑制子活性和致病性所必需的區域[9]。甘薯褪綠矮縮病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV)RNA1 3′端編碼的P22蛋白能夠抑制由雙鏈RNA(dsRNA)誘導的RNA沉默，同時P22也可以抑制沉默信號的傳導以及系統性沉默[10-11]。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)RNA1編碼的P22可以抑制由正義RNA和dsRNA引起的基因沉默，但是不能抑制沉默信號在細胞間擴散或長距離移動[12]，突變P22蛋白中的鋅指結構域，發現P22的dsRNA結合能力和沉默抑制子活性不受影響[13]，用缺失P22的ToCV RNA1突變體和完整RNA2侵染本氏煙，依然能夠成功侵染，卻發現缺失P22會增加RNA1的積累量，但RNA2的積累量顯著降低，表明P22能夠維持ToCV RNA1和RNA2的平衡[14]。

P22作為病毒的沉默抑制子在病毒的致病過程中發揮重要作用，目前有關CCYV P22的研究較少。本研究通過免疫沉淀技術(Immunoprecipitation)篩選與P22互作的候選寄主蛋白，使用串聯質譜技術對蛋白質多肽分子進行鑒定分析，通過生物信息學分析確定下一步研究的8個蛋白，分別構建酵母載體進行酵母共轉化驗證，以確定互作關系，為闡明P22蛋白在CCYV侵染過程中的作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 本氏煙(Nicotianabenthamiana)種植于河南農業大學土傳病害課題組實驗室溫室中。

1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌DH5α感受態細胞及農桿菌GV3101感受態細胞購于莊盟生物公司，酵母Y2H Gold菌株來自河南農業大學土傳病害課題組實驗室，均保存于-80 ℃冰箱。pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGBKT7-P22及pGD3flagP22載體由本實驗室保存。

1.1.3 試劑和儀器 Primerstar Max高保真酶、r-TaqDNA聚合酶、DNA Marker以及抗生素AbA為TaKaRa公司產品；限制性內切酶、T4DNA連接酶為NEB公司產品；M-MLV反轉錄酶為Promega公司產品；一步克隆試劑盒為諾唯贊公司產品；DMSO和高靈敏度化學發光檢測試劑盒(eECL Western Blot Kit)為Sigma公司產品；X-α-Gal為北京啟維益成科技有限公司產品；卡那霉素、氨芐霉素、利福平、PVDF膜等為北京索萊寶科技有限公司產品；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒為生工生物工程上海股份有限公司產品；其他試劑為進口和國產分析純。

電泳儀購自北京六一儀器廠；控溫搖床購自上海精宏有限公司；PCR儀為ABI以及Eppendorf產品；凝膠成像系統為美國Proteinsimple產品；高速離心機、超顯微紫外分光光度計以及Nanodrop為Thermo產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫沉淀技術篩選互作候選蛋白 將表達載體pGD3flagP22轉化農桿菌感受態GV3101，挑取單菌落驗證正確后搖菌。將含有表達載體pGD3flagP22的農桿菌菌液浸潤本氏煙葉片下表皮，2 d后采集浸潤葉片；加入提取緩沖液(10%甘油、25 mmol/L Tris(pH值7.5)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、150 mmol/L NaCl、2%聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、1×蛋白酶抑制劑、0.1% 乙基苯基聚乙二醇(NP40))，從約2.0 g的本氏煙葉片中提取總蛋白質；振蕩混勻后在水平搖床上80 r/min冰浴30 min，4 ℃離心取上清，加入20 μL的FLA-M2單克隆抗體親和凝膠(Sigma-Aldrich)孵育2 h(加入前吸取部分上清液為后續的檢測做對照)；孵育結束后離心收集瓊脂糖珠，用IP緩沖液(10%甘油、25 mmol/L Tris(pH值7.5)、1 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、0.1% NP40)洗滌至少3次，最后在30 μL IP緩沖液中重新懸浮。將IP樣品在95 ℃下加熱10 min，用anti-Flag抗體進行蛋白質印跡檢測。

1.2.2 LC-MS/MS分析 將Western Blot檢測后的剩余蛋白質樣品送至上海中新新生命科技有限公司進行鑒定分析。

1.2.3 蛋白質數據分析 對質譜結果進行分析整理，利用在線Gene ontology(GO)數據庫進行分析，分別從生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)描述寄主蛋白的相關功能。

1.2.4 候選寄主蛋白的引物設計 根據質譜分析結果篩選出P22互作候選寄主蛋白后，基于NCBI已經發表的基因序列，通過DNAMAN軟件設計擴增全長閱讀框且攜帶EcoR Ⅰ和XhoⅠ一步克隆酶切位點的引物(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 互作寄主因子全長閱讀框的擴增 選取生長健康本氏煙葉片為材料，用TRIzol法提取總RNA[15]。用超顯微紫外分光光度計檢測RNA的濃度與純度，利用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄合成第一鏈cDNA。使用Primerstar Max高保真酶擴增候選寄主蛋白全長閱讀框序列，PCR反應體系為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。將所獲得的PCR產物通過PCR純化回收試劑盒回收純化。

1.2.6 互作寄主因子結構域分析 用SMART在線分析(http：//smart.embl-heidelberg.de)預測這8個候選寄主蛋白(SAMS1、SAMS2、PKA、GAPC1、GAPC2、GAPDH-A、ATG3、ATG7)的功能域。

1.2.7 酵母雙雜交載體的構建 使用限制性內切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切載體pGADT7和PCR產物(SAMS1、SAMS2、PKA、GAPC1、GAPC2、GAPDH-A、ATG3、ATG7)，純化回收后將二者通過一步克隆法連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態，篩選并測序后得到正確的pGADT7表達載體。

1.2.8 酵母雙雜交技術驗證互作 將正確的pGADT7表達載體和pGBKT7-P22共轉化酵母感受態Y2H Gold，以pGADT7-T+pGBKT7-53為陽性對照，pGADT7-T+pGBKT7-Kam、pGADT7+pGBKT7-P22以及pGADT7 +pGBKT7為陰性對照，研究重組pGADT7表達載體與pGBKT7-P22之間的相互作用關系，將含有對照及樣品的酵母菌分別涂布于含有SD/-Trp/-Leu及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-Gal培養基上。

2 結果與分析

2.1 免疫沉淀技術篩選互作候選寄主因子及GO功能分析

將通過anti-Flag磁珠富集的與P22互作的本氏煙總蛋白質進行質譜檢測，共獲得128個寄主蛋白。對質譜結果進行GO分析，發現篩選到的與P22蛋白相互作用的寄主蛋白分為39個功能組，分別屬于生物過程、分子功能和細胞組分三大類別。在生物過程(BP)類別中光合作用(6個)、蛋白質折疊(5個)、葡萄糖代謝過程(5個)、碳代謝過程(5個)、S-腺苷甲硫氨酸生物合成過程(4個)為主要功能組；從分子功能(MF)角度來看，篩選到的寄主蛋白主要發揮ATP結合(32個)、金屬離子結合(8個)、轉移酶活性(6個)、鋅離子的結合(5個)、蛋白激酶活性(5個)等功能；在細胞組分(CC)類別中生物膜(11個)、細胞質(7個)、光系統Ⅱ氧化復合體(5個)、葉綠體(4個)為主要功能組(圖1)。

2.2 互作寄主因子的KEGG功能分析

由于P22蛋白作為CCYV編碼的沉默抑制子發揮作用，結合質譜分析結果，根據富集肽段數目和蛋白質功能篩選出8個候選寄主蛋白(表2)。根據KEGG數據庫的注釋信息，對8個候選寄主蛋白參與的代謝途徑進行注釋。KEGG數據庫分析表明，8個候選寄主蛋白可能參與或涉及的代謝通路主要包括次生代謝物的生物合成、微生物代謝、碳代謝、氨基酸的生物合成、糖降解/糖異生、光合生物中的碳固定、HIF-1信號通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝等，大類可以歸為寄主體內的碳水化合物代謝、能量代謝以及信號轉移等3個代謝途徑(表3)。其中與代謝通路相關的蛋白質共有6個，與次生代謝物的生物合成和氨基酸的生物合成相關的蛋白質有5個，與微生物代謝、碳代謝及光合生物中的碳固定相關的蛋白質有4個，與糖降解/糖異生和HIF-1信號通路相關的蛋白質有3個。

表2 與CCYV P22互作的本氏煙蛋白Tab.2 Proteins in Nicotiana benthamiana interacting with CCYV P22

表3 互作蛋白代謝途徑分析Tab.3 The metabolic pathways analysis of interacted host proteins

2.3 互作寄主因子全長閱讀框的擴增及結構域分析

以本氏煙cDNA為模板，使用Primerstar Max高保真酶PCR擴增互作寄主因子的全長閱讀框，得到8個特異性條帶(圖2)，純化回收DNA，將其分別構建到酵母載體pGADT7上，獲得重組載體。用SMART在線分析(http：//smart.embl-heidelberg.de)預測這8個候選寄主蛋白的功能域(圖3)。SAMS蛋白由3個S-AdoMet_synt結構域組成，參與碳代謝途徑(圖3-A、B)；PKA蛋白由PGK結構域組成(圖3-C)；GAPC1和GAPC2蛋白由一個位于N端的Gp_dh_N結構域和位于C端的Gp_dh_C結構域組成(圖3-D、E)；GAPDH-A蛋白由一個位于N端的Gp_dh_N結構域和位于C端的Gp_dh_C結構域組成，而且在N端還有一個低復雜區(圖3-F)；ATG3蛋白由位于N端的Autophagy_N結構域、位于中間的Autophagy_act_C結構域和位于C端的Autophagy_C結構域組成(圖3-G)；ATG7蛋白由位于N端的ATG7_N結構域和ThiF結構域，以及位于C端的低復雜區組成(圖3-H)。

M.DNA Marker；1.SAMS1 PCR產物(1 173 bp)；2.SAMS2 PCR產物(1 173 bp)；3.PKA PCR產物(1 446 bp)；4.GAPC1 PCR產物(1 023 bp)；5.GAPC2 PCR產物(1 014 bp)；6.GAPDH-A PCR產物(1 206 bp)；7.ATG3 PCR產物(960 bp)；8.ATG7 PCR產物(2 142 bp)。

2.4 酵母雙雜交技術驗證互作

將測序正確的pGADT7重組載體和pGBKT7-P22共轉化酵母感受態Y2H Gold，結果表明，酵母菌在二缺培養基上均能生長，說明重組質粒成功轉入酵母菌中，其中pGBKT7-P22/pGADT7-GAPDH-A及陽性對照能夠在缺陷型培養基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長，說明GAPDH-A蛋白與P22蛋白有相互作用。進一步將其在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-Gal培養基培養并觀察，發現陽性對照和組合pGADT7-GAPDH-A+pGBKT7-P22可以變藍并生長，陰性對照和其他組合變紅且不生長(圖4)，表明GAPDH-A和P22能夠互作。

3 結論與討論

CCYV是2010年正式報道命名的新病毒，該病毒引起的病害發生重，蔓延快，已經成為瓜類作物上的一種重要病害[16]。位于CCYV RNA1 3′末端的P22蛋白已被證實是CCYV的沉默抑制子[9]，因此，篩選與P22蛋白互作的寄主因子對明確病毒的侵染機制有重要意義。

本研究通過免疫沉淀技術篩選出8個互作寄主因子，其中ATG7蛋白未能獲得正確的pGADT7表達載體，故未進行后續的酵母雙雜交驗證。根據KEGG數據庫分析表明，篩選到的寄主蛋白涉及10個具體的代謝途徑分支，其中與代謝通路相關的蛋白質共有6個，與次生代謝物生物合成和氨基酸生物合成相關的蛋白質有5個，與微生物代謝、碳代謝及光生物中的碳固定相關的蛋白質有4個，與糖降解/糖異生和HIF-1信號通路相關的蛋白質有3個。說明互作的寄主蛋白參與到寄主植物的碳水化合物代謝、能量代謝以及信號轉移等代謝途徑中，從而影響寄主的生長發育。

A.SAMS1的功能域；B.SAMS2的功能域；C.PKA的功能域；D.GAPC1的功能域；E.GAPC2的功能域；F.GAPDH-A的功能域；G.ATG3的功能域；H.ATG7的功能域。數字單位為dal。

圖4 酵母雙雜交檢測P22與寄主蛋白的相互作用Fig.4 Yeast two-hybrid detection of interaction between P22 and host proteins

通過酵母雙雜交驗證7個互作寄主因子，結果顯示，GAPDH-A蛋白與P22蛋白互作。3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是碳代謝中的關鍵酶之一，催化3-磷酸甘油醛轉化為含高能磷酸鍵的1，3-二磷酸甘油酸，進一步反應生成3-磷酸甘油酸和ATP。近年來的研究表明，GAPDH具有功能多樣性，參與植物的生長發育、花粉管萌發、光合作用和自噬途徑等[17-19]，并且能夠響應多種生物和非生物脅迫[20-24]。GAPDH也參與了病毒侵染植物過程，作為碳代謝中的重要酶，GAPDH促進了番茄叢矮病毒(Tomatobushystuntvirus，TBSV)的RNA非正常合成，導致TBSV基因組RNA積累量減少[25]。柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)利用GAPDH與病毒蛋白P23互作，促進病毒侵染[26]。同時，GAPDH還促進了黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)復制酶p1a和p2a的互作[20]。除此之外，木爾坦棉花曲葉病毒衛星(CottonleafcurlMultanbetasatellite，CLCuMuB)βC1可以通過破壞GAPDH與ATP3之間的互作而激活植物自噬[27]。

GAPDH-A蛋白是葉綠體定位GAPDH的一個亞基，主要位于植物和藻類的葉綠體中，參與卡爾文-本森循環[28-29]。GAPDH-A可以輔助紅三葉草壞死花葉病毒(Redclovernecroticmosaicvirus，RCNMV)的運動蛋白MP正確定位于病毒運動復制復合體的膜上，從而完成病毒的侵染[30]。推測GAPDH-A蛋白可能通過與P22蛋白互作而促進CCYV侵染。同時P22蛋白與GAPDH-A蛋白互作可能影響其功能，從而影響植物的正常代謝過程，導致植物出現褪綠黃化癥狀。本研究為進一步闡明P22蛋白在CCYV侵染過程中發揮的作用機制奠定了基礎，有助于解析CCYV的致病機制。