Gsk-3β、CD82和Axin1在乳房和乳房外Paget病中的表達

魏麗萍 周文文 王皓敏 張士發

1錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧沈陽，110016；2大連醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧沈陽，110016；3東北國際醫院皮膚科，遼寧沈陽，110623

Paget病(Paget’s disease)又稱為濕疹樣癌(eczematoid carcinoma)，是一種少見的皮損表現為濕疹樣外觀的低度惡性表皮內腺癌，其組織病理特點是在表皮內發現Paget細胞，臨床上可分為乳房Paget病(mammary Paget’s disease，MPD)和乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease，EMPD)。Gsk-3β可以調節多種類型腫瘤細胞的代謝、增殖與凋亡，對腫瘤的發生具有雙重調節作用。CD82具有抑制腫瘤轉移的作用。Axin1發揮抑制腫瘤的功能。目前Gsk-3β、CD82和Axin1已被證明參與乳腺癌、惡性黑素細胞瘤、皮膚鱗癌等多種腫瘤的發生與發展，但其在MPD和EMPD中的作用國內外尚未有報道，為探究其在MPD和EMPD中的作用，本研究通過免疫組化方法檢測Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表達情況，分析其相關性，從而探討它們在MPD和EMPD發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集北部戰區總醫院皮膚科2007年4月至2019年8月病理診斷為MPD和EMPD患者的蠟塊和病歷資料各20例，并且患者確診前均未行放療或化療治療。另收集本科室就診的良性皮膚病患者的正常皮膚組織蠟塊10例為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Gsk-3β單抗(bs-0028R)、兔抗人CD82單抗(bs-1470R)、兔抗人Axin1單抗(bs-2439R)、免疫組化染色試劑盒(SP-0023)、DAB 試劑盒(CO2-04001)均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色 石蠟塊切片(5 μm厚)、烤片、脫蠟、水化，高壓修復抗原(100×檸檬酸鈉修復液與蒸餾水按照1∶100稀釋，高壓鍋上汽后修復4 min)，按免疫組化染色試劑盒操作說明書進行染色(PAP筆在組織片周圍2～3 mm畫一閉合圓圈，滴加3%H2O2，37℃孵育20 min，PBS液洗5 min×3次，滴加試劑A，37℃孵育20 min，傾去，勿洗，滴加1∶500稀釋一抗，4℃過夜，37℃復溫1 h，PBS液洗5 min×3次，滴加試劑B，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次，滴加試劑C，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次)，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片。PBS液作陰性對照。

1.4 結果判定 由我科兩位經驗豐富的皮膚病理醫師采用雙盲法鏡檢閱片，每張切片在顯微鏡下隨機選取5個視野，放大400倍觀察評估。在細胞質或細胞膜呈黃色或棕色顆粒狀沉積視為陽性染色。染色強度評分：無染色計0分，弱染色(淡黃色)計1分，中度染色(棕黃色)計2分，強染色(棕褐色)計3分。陽性細胞百分比評分：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。免疫組化評分=陽性細胞百分比×染色強度積分。0～4分為陰性或低表達，5～8分為中度表達，9～12分為高表達[1]。

2 結果

2.1 Gsk-3β在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達 三組間的表達差異具有統計學意義(P<0.001)，但MPD與EMPD相比差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 CD82在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達 三組間的表達差異具有統計學意義(P<0.001)，且MPD與EMPD相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 Axin1在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達 三組間的表達差異具有統計學意義(P<0.001)，但MPD與EMPD相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1和圖1。

表1 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達

2.4 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD中表達的相關性 Gsk-3β和CD82在MPD中的表達無相關性(r=-0.291，P=0.212)，Gsk-3β和Axin1在MPD中的表達無相關性(r=0.236，P=0.316)。CD82和Axin1在MPD中的表達無相關性(r=0.039，P=0.869)。

2.5 Gsk-3β、CD82和Axin1在EMPD中表達的相關性 Gsk-3β和CD82在EMPD中的表達無相關性(r=0.261，P=0.266)，Gsk-3β和Axin1在EMPD中的表達無相關性(r=0.392，P=0.088)。CD82和Axin1在EMPD中的表達無相關性(r=0.362，P=0.117)。

1a: Gsk-3β在MPD中低表達；1b: Gsk-3β在EMPD中低表達；1c: Gsk-3β在正常皮膚組織中中度表達；1d：CD82在MPD中中度表達；1e：CD82在EMPD中低表達；1f：CD82在正常皮膚組織中高表達；1g：Axin1在MPD中低表達；1h：Axin1在EMPD中低表達；1i：Axin1在正常皮膚組織中中度表達；1a～1i均主要表達于細胞胞質、胞膜

3 討論

Gsk-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過調控Wnt/β-catenin、PI3K/PTEN/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等通路，參與細胞代謝、增殖、分化、凋亡等多種細胞過程[2]。有報道在近端胃癌患者中，Gsk-3β陽性表達明顯低于胃正常組織，且Gsk-3β陽性表達的降低與胃癌的分期、分化、浸潤及淋巴轉移呈明顯負相關，其在近端胃癌的發生、發展、浸潤及淋巴轉移等方面起到重要的抑制作用[3]。在神經膠質瘤中，Gsk-3β過表達可抑制Wnt/β-catenin和mTOR/p70S6K1信號通路，使HIF-1和VEGF低表達，抑制了腫瘤的血管生成及生長，從而抑制了神經膠質瘤的進展[4]。在鼻咽癌中，Gsk-3β失活可增加EZH2蛋白的穩定，導致EZH2過度表達，促進腫瘤遷移和增強其侵襲能力，從而促進鼻咽癌的發生、發展，可能是鼻咽癌治療的未來潛在靶標[5]。本研究首次發現Gsk-3β在MPD、EMPD中的表達顯著低于正常皮膚組織，三者表達強度具有顯著性差異，且MPD與EMPD相比差異無統計學意義(P<0.05)，Gsk-3β在MPD、EMPD中的低表達，與上述相關研究結果一致[3-5]，提示Gsk-3β可能通過同種信號通路對乳房和乳房外Paget病的發生及發展起抑制作用。Gsk-3β在上述癌癥中的低表達對腫瘤的發生、發展起促進作用，因此Gsk-3β可能為腫瘤的診斷、進展及治療提供新的作用靶點和思路。

CD82是KAI1編碼的能抑制腫瘤轉移的細胞膜糖蛋白，可與其他四跨膜蛋白、非四跨膜蛋白形成四跨膜蛋白網絡發揮生理功能，影響腫瘤細胞的增殖、黏附、運動和侵襲，誘導細胞凋亡和衰老[6]。研究發現在乳腺癌患者中，KAI1/CD82陽性表達顯著低于乳腺正常組織，且CD82表達強度與乳腺癌分期、淋巴結轉移呈負相關，其在乳腺癌的發生、發展及轉移等方面有重要的抑制作用[7]。在子宮內膜癌患者中，CD82陽性表達顯著低于正常子宮內膜組織，且表達強度與子宮內膜癌的分期、分化、浸潤程度及淋巴結轉移呈明顯負相關，CD82的低表達促進了腫瘤的發生、發展和轉移，其表達異常可協助判斷腫瘤轉移、評估預后和指導治療[8]。本研究首次發現CD82在EMPD中的表達低于MPD，且兩者顯著低于正常皮膚組織，三組間的表達差異均有統計學意義，MPD與EMPD相比差異有統計學意義(P<0.05)，CD82在MPD和EMPD中的低表達，與已有研究結果一致[7，8]，提示CD82可能通過不同信號通路對乳房和乳房外Paget病的發病過程起抑制作用。CD82的低表達或下調與許多惡性腫瘤的不良預后密切相關，因此CD82可作為預測腫瘤患者疾病進展及預后的參考。

Axin1是一種包含多結構域的支架蛋白，可以與多種不同的蛋白質復合物結合，參與Wnt、p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等多種信號通路，從而抑制腫瘤的發生和發展，是一種腫瘤抑制因子[9]。據報道在肝癌組織中，Axin1低表達與miR-650的高表達呈負相關，Axin1的過表達顯著抑制了腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，而用miR650處理后則消除了Axin1對腫瘤的抑制能力，因此Axin1和miR-650可以協助腫瘤的早期診斷、治療和預后[10]。在肺癌中，野生型Zbed3與Axin結合，可通過抑制Axin/TPC/GSK-3β復合物的降解來上調β-catenin表達和Wnt信號活性來促進肺癌增殖和侵襲，而在缺少Axin結合位點的Zbed3突變體中卻未能增強β-catenin的表達，其過程依賴Axin[11]。本研究首次發現，Axin1在MPD、EMPD中的表達顯著低于正常皮膚組織，三者表達強度具有顯著性差異，且MPD與EMPD相比差異無統計學意義(P>0.05)，Axin1在MPD、EMPD中的低表達，與現有研究結果一致[10，11]，提示Axin1可能通過同種信號通路對乳房外和乳房Paget病的發病過程發揮抑制作用。Axin1是腫瘤發生和進展的抑制因子，穩定或上調Axin1的表達可抑制腫瘤的增殖和侵襲，可成為腫瘤治療的潛在靶點。

既往未見Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中表達相關性的研究。本研究發現，Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表達并無協同作用，雖然Axin1和Gsk-3β均可通過經典的Wnt/β-catenin信號通路影響腫瘤的發生、發展[3，9]，而CD82可以減少β-catenin的磷酸化和核內聚集，對Wnt/β-catenin信號通路有抑制作用[6]，但Gsk-3β還可通過Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等信號通路對腫瘤產生影響，Axin1也可通過與Gsk-3β不同的信號通路發揮抑制腫瘤的作用，如p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等信號通路，至于它們的表達調控是否有相互作用及其機理還有待進一步研究。