基于熒光免疫分析技術的食品中污染物檢測方法研究進展

杜 戎，虞睿寧，袁 好，張倩瑤，郭亞輝, ，姚衛蓉，錢 和

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.桐廬縣檢驗檢測中心，浙江杭州 311500）

食品安全是世界各國共同關注的重大公共衛生問題，關乎人民生命健康、經濟發展和社會穩定。受原材料、加工技術以及生態環境的影響，食品污染物殘留問題時常發生，成為威脅人類健康的一大隱患。常見的食品污染物包括農藥殘留、獸藥殘留、真菌毒素、有害微生物等。傳統的食品污染物檢測技術以儀器分析方法為主，如電化學法、光譜法、色譜法、質譜法等[1?2]，液相色譜-串聯質譜法[3?4]、氣相色譜-質譜法[5?6]等聯用方法在食品化學污染物的多重定量檢測中取得了重要進展。儀器分析方法測定結果準確、抗干擾能力強、穩定性可靠，但也往往存在操作復雜、檢測時間長、檢測成本高、設備不便攜帶等不足，難以滿足快速、高效、廉價、便捷的現場檢測和批量篩選需求。免疫分析技術利用抗體與相應抗原或半抗原之間自發的免疫學反應實現對各類食品污染物的快速、準確、簡便和特異性檢測，彌補了傳統食品污染物檢測技術的缺陷。常見的免疫分析技術有膠體金免疫層析技術、熒光免疫分析技術、放射免疫分析技術、酶聯免疫吸附技術和化學發光免疫分析技術等。其中，熒光免疫分析技術（fluorescence immunoassay，FIA）以熒光物質標記抗體（或抗原），基于抗原-抗體反應，利用待測物質在反應體系中特異結合位點熒光的強弱，定性或定量分析以得出檢測結果，近年來憑借較高的靈敏度在生物[7]、醫藥[8]、環境[9]等領域得到廣泛應用，在食品污染物檢測領域發展尤為迅速。

自20世紀40年代發展至今，熒光免疫分析技術正在走向成熟，標記材料日趨豐富。Coons等于1941年首次采用熒光素標記抗體而成功進行了抗原定位，熒光免疫分析技術由此產生[10]。基于熒光分子具有易實現多次激發的特點，Ambrose、Mathies和Nguyen等實現了熒光單分子檢測[11]；1983年，Soini和Kojola等使用鑭系元素作為標記物，建立了時間分辨熒光免疫分析技術，有效排除了樣品中的非特異熒光干擾，提高了熒光免疫分析技術的靈敏度[11]。隨著量子點制備技術不斷提高，其作為標記材料用于生物學研究逐漸成為可能，陸續有研究者發表以量子點作為生物探針的論文，將其作為熒光標記應用于檢測領域，掀起量子點的研究熱潮。

隨著材料科學領域的不斷進步，上轉換發光納米材料、熒光蛋白和磁性熒光納米材料等新型材料也逐漸走入研究人員的視線。這些新材料、新技術的出現，推動了熒光免疫分析技術更好地融合熒光材料、免疫學和儀器分析技術的發展成果，不僅靈敏度高、特異性好，還有實現檢測自動化、智能化的潛力。本文綜述了熒光免疫分析技術中的3類常用熒光標記材料和3類新型熒光標記材料，比較了各類熒光材料的光學特性和分析性能，闡述了熒光免疫分析技術在食品污染物檢測中的研究進展并重點介紹了多重定量檢測、熒光共振能量轉移及比率熒光分析等熱門技術在食品污染物檢測中的應用，以期幫助讀者更全面地了解熒光免疫分析技術中的發展現狀，更深入地認識熒光免疫分析技術在食品污染物檢測領域的應用價值，為新型熒光免疫分析技術的研發和食品污染物檢測方法的構建提供一定的理論指導依據。

1 常用熒光標記材料

1.1 普通熒光染料微球

熒光素是一類能產生明顯熒光的有機染料，是最早應用于免疫分析技術的熒光物質。這類材料價格低廉，在熒光免疫分析技術中應用非常廣泛。目前，FIA中使用的熒光素主要有兩類：一類可被紫外光直接激發，如異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等；另一類則本身沒有熒光效應，需要經酶催化才能形成強熒光物質，如4-甲基傘酮-β-D、4-甲基傘酮磷酸鹽和對羥基苯乙酸等[10]。任姿靜等[12]以異硫氰酸熒光素為標記物，建立了一種高靈敏、高選擇性、低成本檢測赭曲霉毒素的新型免疫熒光分析法，在最佳實驗條件下熒光強度的變化值（ΔF）與赭曲霉毒素濃度的對數在1 nmol/L～100μmol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限為0.35 nmol/L，這在食品安全領域中具有潛在應用價值。

然而，大部分熒光素穩定性差，光照時易發生分解和光漂白，低濃度下信號微弱，高濃度下易淬滅，影響了分析結果的準確性和可靠性[13]。通過化學偶聯法、包封法、物理吸附法、共聚法和自組裝等方法[14]，將熒光素吸附或包埋于載體材料中制成納米級或微米級的熒光微球（fluorescent microspheres，FMs），能有效改善其光學性質和分析性能。熒光微球采用核殼結構，外層載體材料主要有單體材料（如聚苯乙烯、SiO2、ZnS等）和聚合物材料（如聚乳酸微球、淀粉微球、殼聚糖微球等）[15]。熒光微球比表面積大、吸附性強、凝集作用大、表面反應能力強，與普通熒光素相比形態結構更穩定、發光效率更高，具有良好的單分散性、重復性和生物相容性，尤其適用于微生物、蛋白質及生物小分子的檢測分析[14?15]。程敏等[16]采用熒光微球納米粒子作為免疫標記物，偶聯黃曲霉毒素B1單克隆抗體制備納米探針，建立了針對決明子基質中黃曲霉毒素B1的熒光微球免疫層析定量檢測方法。該方法的線性范圍為0.1～2.0 ng/mL，靈敏度為0.034 ng/mL，特異性良好，檢測結果與高效液相色譜法一致，可滿足對現場大批量決明子樣本快速定量篩查的需求。

近5年來，以熒光素為標記材料的食品污染物檢測方法研究熱度并不高，而熒光微球的核殼式結構作為一種穩定、高效的結構被多次應用于量子點、時間分辨熒光材料中制成量子點微球、時間分辨熒光微球。同時，多色熒光微球還為食品污染物多組分分析方法開辟了新思路。Zhang等[17]首次研制了一種以雙色熒光微球為標記物的多重免疫分析方法，采用該方法對魚類樣品中微囊藻毒素-LR和岡田酸進行檢測，檢測限分別為0.074和2.42μg/kg，回收率達到89%以上。檢測能在20 min內完成，結果與高效液相色譜-串聯質譜法差異不大，為多種食品污染物的現場檢測提供了高效、可靠、靈敏的方法。

1.2 量子點

量子點（quantum dots，QDs）是一種納米級別的半導體材料，粒子半徑小于或接近激子玻爾半徑，包括由Ⅰ～Ⅵ族、Ⅲ～Ⅴ族、Ⅳ～Ⅵ族、Ⅴ～Ⅵ族元素組成的納米晶，以及金簇、銀簇、硅點、碳點、復合熒光納米粒子等[18]。單核型的QDs存在表面缺陷，通常采用Cd Se/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、CdS/HgS、CdSe/CdS/ZnS、Cd Te/ZnS等核殼體系，改善量子點的穩定性和產率[19]。

量子點具有強而穩定的熒光信號，對化學物質和生理代謝降解的抵抗力很強，有良好的光漂白能力。其顏色也豐富多樣，通過調節量子點的粒徑尺寸就能得到不同的熒光顏色，用于多色標記。在實際應用中，為使量子點具有更好的生物相容性，研究者們通常進行表面修飾，既有利于QDs與抗原或抗體的偶聯，也能降低QDs的毒性[20]。量子點因其獨特的光學性質常被用作新型的熒光標記材料，取代原有的熒光染料分子，與熒光免疫分析技術相結合，應用于生物體內病菌和毒素的檢測[21]。

量子點的多色性常用于同一體系中多種食品污染物的同時檢測，以縮短檢測時間，提高檢測效率。Duan等[22]建立了一種用3個試驗系和1個控制系同時對玉米樣品中玉米烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）和伏馬菌素B1（FB1）進行定性檢測的多重免疫色譜法（mICA）。將CdSe/ZnS量子點封裝合成3個具有黃色、橙色和紅色發光特性的量子點納米線，與抗OTA單克隆抗體、抗FB1單克隆抗體和抗ZEN單克隆抗體偶聯，分別用于OTA、FB1和ZEN的檢測，最終得到OTA、FB1和ZEN的檢測限分別達到5、20和10 ng/mL，可用于農產品中的多種霉菌毒素的檢測。廖蕓[23]基于熒光量子點，建立了三唑磷、對硫磷和毒死蜱農藥多殘留熒光免疫分析方法。

多目標物定量檢測時常常會受到目標物濃度的干擾，以傳統的抗鼠IgG 抗體噴涂試紙條C線，T/C比值法進行試紙條多重定量的準確度和穩定性差，無法滿足實際定量檢測的需求。邵艷娜[24]構建的基于量子點熒光微球（QBs）免疫層析法多重定量檢測黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B1和赭曲霉毒素A的新方法解決了這個問題，原理如圖1所示。通過引入鏈霉親和素-生物素系統作為一個獨立的控制線（control line，C線），消除不同批次試紙條，溫濕度、反應時間，甚至是加樣誤差等不可控因素對試紙條免疫反應的影響，操作也更簡單，檢測結果準確可靠。

圖1 量子點熒光微球多重免疫層析試紙條定量檢測AFB1、FB1和OTA 的原理圖[24]Fig.1 Schematic diagram of quantitative detection of AFB1,FB1 and OTA by multiple immunochromatographic strips with quantum dot fluorescent microspheres[24]

傳統的競爭性酶聯免疫分析法（cFELISA）是用辣根過氧化物酶（HRP）作為競爭抗原的載體，但其靈敏度往往達不到快速檢測的標準。新型信號傳感器的應用雖然能有效提高靈敏度，但在實際工業化操作過程中實施起來還存在很多困難。而Lu等[25]用伏馬菌素B1標記的過氧化氫酶（CAT）替代HRP，通過降低競爭抗原與抗體的結合親和力，同時調節酶與抗原的偶聯比率，有效增強熒光信號強度，建立了一種高效靈敏檢測伏馬菌素B1的競爭熒光酶聯免疫吸附法，比傳統的基于HRP的酶聯免疫吸附試驗的結果低15倍。Zhou等[26]基于同樣方法，用150 nm量子點微珠作為競爭抗原載體，實現巴氏殺菌乳、酸奶和奶粉中黃曲霉毒素M1的超靈敏檢測。

近年來，量子點也常被用于熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）以及比率熒光分析法中。徐威[27]將綠色量子點和紅色量子點分別與抗黃曲霉毒素B1（AFB1）偶聯，利用抗原抗體之間的特異性反應以及FRET體系，建立了AFB1均相競爭免疫新方法，成功應用于AFB1的定量檢測。Willard等[28]將生物素化的牛血清白蛋白（bBSA）與四甲基羅丹明標記的鏈霉親和素特異性結合，構建基于量子點的熒光共振能量轉移體系，使得四甲基羅丹明的熒光強度大大增強，提高了檢測的靈敏度。基于量子點的FRET體系常用于比率熒光探針的制備過程。He等[29]將CQDs作為能量供體，金納米團簇（AuNCs）作為受體，制作了一種新型的基于FRET體系的比率熒光傳感器用于檢測多巴胺含量，其檢測結果肉眼可見、準確度高，同時低毒性的供體和受體有利于其在生物分析領域的應用。

1.3 時間分辨熒光材料

時間分辨熒光材料一般是指鑭系稀土元素，包括銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）等，常用于時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。鑭系稀土元素熒光壽命較普通的熒光標記物壽命長，且Stokes位移較大，待短壽命背景熒光消失后，測定長壽命的鑭系稀土元素螯合物熒光（如圖2）[30]，可避免背景熒光的干擾，達到定量分析的目的。

圖2 時間分辨熒光測定原理[31]Fig.2 Principle of time resolved fluorescent materials[31]

由于實現了特異性熒光與非特異性熒光分離，發射熒光與激發熒光分離，時間分辨熒光材料具有很高的特異性和靈敏度。較強的熒光性和穩定的螯合物也使得時間分辨熒光材料的線性范圍更寬，重復性更好。同時，時間分辨熒光材料還具有高穩定性和多標記等優勢[32]。因此，這種材料已廣泛應用于生命科學、醫學、生物學、化學等各領域。但由于鑭系稀土元素在標記過程中的繁瑣操作以及螯合劑的使用，時間分辨熒光材料的處理過程相比于普通熒光材料更為復雜。

目前最常見的抗原或抗體標記物是銪和釤，且廣泛應用于多組分檢測或多標記檢測中。而將鋱和鏑作為標記物的檢測方法相對較少，目前處于研究階段。朱建國[33]將抗玉米赤霉烯酮毒素（ZEA）、抗黃曲霉毒素B1（AFB1）和抗百菌清（CTN）3種高特異性單克隆抗體與銪微球偶聯制備免疫熒光探針，通過優化抗體標記濃度、熒光探針用量、免疫試劑用量、免疫層析條件等，建立了一種能同時檢測真菌毒素和農藥殘留的時間分辨免疫熒光層析方法，ZEA、AFB1和CTN的檢出限分別為0.043、0.011和0.084 μg/kg，在做到省時省試劑的同時，保證了準確度和穩定性，具有良好的市場應用價值。多標記檢測已成為現有檢測技術發展的一種趨勢，可用于多種分子的篩查實驗和貴重樣品的檢測。利用不同鑭系金屬離子熒光波長和熒光衰變時間的差異，通過TRFIA法進行測量達到目的。雙標記 TRFIA具有同時檢測兩種物質且無互相干擾的特點，省時、省力和省試劑，在獸藥和農藥殘留中得到廣泛應用，最常用的兩對鑭系金屬離子分別是Eu3+和Sm3+，Eu3+和Tb3+。Bacigalupo等[34]以銪（Eu3+）和鋱（Tb3+）為熒光標記物，建立了一種檢測氫化可的松和鹽酸克倫特羅的雙標記時間分辨熒光免疫分析法，并成功應用于食品檢測中。Sheng等[35]以銪（Eu3+）和釤（Sm3+）為熒光標記物，檢測食品中的噻蟲胺和烯唑醇，在優化的檢測條件下，噻蟲胺的最大半抑制濃度（IC50）和檢出限（LOD，IC10）分別為5.08和0.021μg/L，烯唑醇為13.14和0.029μg/L，具有較高的靈敏度。

時間分辨熒光材料具有靈敏度高、穩定性好、檢測范圍廣等優勢。其中，靈敏度高最為顯著。許多研究表明，時間分辨熒光材料檢測的靈敏度和準確度一般高于酶聯免疫吸附法（ELISA）和傳統的液相色譜法。Zhou等[36]采用間接TRFIA法定量檢測恩諾沙星，發現其靈敏度顯著高于酶聯免疫吸附法、液相色譜法。時間分辨熒光材料通常依托鑭系金屬螯合物進行檢測，但螯合物的發光信號很容易受到各種猝滅劑的影響，其使用會受到各種限制，靈敏度也會隨之降低。為克服這一缺點，通常用納米顆粒包裹鑭系金屬螯合物，避免外界干擾，同時采用生物素－鏈霉親和素放大系統，可大大提高靈敏度，原理如圖3所示。Tang等[37]在檢測炭疽病毒保護性抗原（PA）時，采用銪納米技術捕捉樣品中的炭疽PA，并結合生物素-鏈霉親和素放大系統，將靈敏度提升為酶聯免疫吸附法的100倍。

圖3 基于納米顆粒的TRFIA測定原理[38]Fig.3 Determination principle of TRFIA based on nanoparticles[38]

近年來，時間分辨熒光材料在熒光共振能量轉移技術以及比率熒光分析法中的應用成為一種發展趨勢。鑭系稀土元素熒光標記物壽命長、Stokes位移較大的優勢彌補了FRET供受體熒光相互干擾的不足。以磷酸三丁酯（TBP）-Eu3+和別藻藍蛋白（APC）為標記物建立的熒光共振能量轉移TRFIA是目前成功的均相分析體系之一。Hepojoki等[39]利用熒光共振能量轉移TRFIA技術檢測漢坦病毒，發現這種新型結合技術在病毒研究方面有很大的應用價值。楊偉強等[40]基于四環素對碳點和銪（Eu3+）的不同影響，建立了一種肉眼可辨的比率熒光分析法檢測四環素殘余量，操作方便，靈敏度高。

展望現有技術，時間分辨熒光材料具有廣闊的發展前景和上升空間，一方面需要在原有基礎上進一步提高檢測靈敏度，另一方面需要結合熒光共振能量轉移技術、比率熒光分析法等進一步深入發展。

2 新型熒光標記材料

2.1 上轉換發光納米材料

上轉換發光納米材料（upconverting nanoparticles，UCNPs）是一種能夠接收低能量激發光并將其轉換成高能量發射光的新型熒光探針材料。上轉換發光納米材料采用近紅外作為激發光源，具有發射光譜特性突出、熒光量子產生率高、反斯托克位移大、熒光壽命長等特點。相對于傳統以有機染料和半導體量子點為代表的下轉換發光材料，上轉換發光材料毒性較低，能在提高對生物組織的穿透深度同時減少長時間照射引起的傷害，消除來自內源性熒光物質和同時標記熒光染料的背景熒光干擾，具有較高的靈敏度和選擇性[41]。基于UCNPs的上轉換發光納米技術（upconversion fluorescence nanoparticles technology，UPNT）能解決食品污染物傳統檢測方法中樣品前處理程序復雜等問題，快速有效地對一些食品污染物進行檢測[42]。

上轉換發光具有多種發光體系，而稀土摻雜（rare-earthdoped，RED）體系是目前效率最高、應用最多的上轉換發光體系。稀土摻雜上轉換納米粒子具有特殊的頻率上轉換能力，主要利用鑭系稀土離子（如Yb3+和Er3+）之間的能量轉移來實現長波長激發光到短波長發射光的轉換，與其他上轉換納米材料相比靈敏度更高。Sheng等[43]結合磁性分離技術建立了阿特拉津的高靈敏度熒光免疫分析方法。如圖4所示，該方法以親水性NaYF4:Yb/Er UCNPs與抗阿特拉津抗體結合作為信號探針，聚苯乙烯磁性微球與包被抗原結合作為捕獲探針，可用于玉米、大米和甘蔗汁基質中阿特拉津的定量檢測，在玉米和大米樣品中的檢測限為20 ng/kg，在甘蔗汁樣品中檢測限為2 ng/L。該方法也能識別丙嗪和異丙嗪，因此可用于對三種除草劑的同時檢測。

圖4 探針的制備過程和使用競爭模型的熒光免疫分析方法的檢測原理[43]Fig.4 Preparation process of the probes and test principle of the fluorescence immunoassay using a competitive format[43]

上轉換發光納米材料的激發和發射光譜較窄，憑借自身優異的光化特性成為FRET的理想能量供體。張瑩瑩等[44]通過上轉換熒光納米材料與金納米粒子之間的熒光共振能量轉移建立了赭曲霉毒素A（OTA）適配體傳感器，實現對OTA的定量檢測。將UCNPs及AuNPs分別修飾OTA適配體和互補鏈制成能量供體探針及受體探針，在最優條件下檢測范圍為0.001～10 ng/mL，檢出限可達0.001 ng/mL。特異性研究及加標回收實驗證明，該方法可用于實際樣品檢測，具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低的優點。

上轉換發光納米材料制備成本較高，且本身不具有親水鍵和活性基團，在應用過程中必須進行表面修飾[45]或合成水溶性稀土化合物[46]。作為一類新型熒光標記材料，上轉換發光納米材料尚存在巨大的發展空間。基于上轉換發光熒光免疫分析技術的食品污染物檢測方法在發射光的可調節性方面已取得了近紅外區激發-可見光區發射、近紅外區激發-近紅外區發射等成果，但仍具有極大的開發潛力。已有研究通過改變鑭系摻雜劑改變上轉換納米探針的光學性質并實現了雙色上轉換納米探針的制備[47]，但雙色探針仍不能滿足多組分分析對檢測效率的需求，需對多色上轉換納米探針的研發和應用予以更多關注。

2.2 磁性熒光納米材料

磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有快速磁響應性，可用于復雜基質的樣品前處理中，以實現對待測物的高效分離和富集[48?50]。磁性熒光納米材料是一種雙功能復合納米材料，常采用穩定的核殼式結構，以Fe3O4等磁性材料為內核，SiO2、C、TiO2等無機材料為夾層，在其內部或表面吸附有熒光素、量子點等熒光材料后經表面修飾制成。這類復合材料實現了免疫磁分離和熒光免疫分析兩個過程的合并，大大簡化了檢測過程，有望解決一些熒光標記物在標記后難以分離的問題，提高檢測的準確性，在食品污染物的免疫分析中具有潛在應用價值[51]。Huang等[52]以熒光磁性納米管為標記物，建立了豬尿基質中克倫特羅的磁性熒光免疫分析方法（如圖5），其定量檢測的范圍為0.25～5 ng/mL，在磷酸鹽緩沖鹽和豬尿樣品中具有相似的檢測限，分別為0.22和0.16 ng/mL，靈敏度比傳統的膠體金試紙條高4倍。該方法的檢測結果與液相色譜-串聯質譜法高度相關，與其他8種高濃度β-腎上腺素受體激動劑區分時也表現出了很強的特異性，可應用于其它的β-腎上腺素激動劑殘留的檢測。

圖5 IMS–FLFIA的步驟示意圖[52]Fig.5 Schematic illustration of the IMS–FLFIA process[52]

然而，磁性材料在提供磁性的同時會引起熒光猝滅，夾層材料的引入能在一定程度上降低影響，但也帶來了粒徑增加和磁響應性降低的問題，仍需尋找最佳的材料組合及組裝方式，在引入其他性能的同時實現對原有性能的保持或增強[53]。Fe3O4應用于熒光磁性納米材料時，其內部過濾效應也可能會對檢測產生干擾。Huang等[54]在磁珠表面共價偶聯量子點制成磁性熒光納米微球，構建了檢測E.coliO157:H7的熒光免疫分析方法，通過控制微球和單克隆抗體的濃度獲得最大的發光強度，有效減弱了材料的內部過濾效應，在試紙條上檢測限達到2.39×102CFU/mL。作為一種新型復合材料，磁性熒光納米材料在材料組合、組裝方式、表面修飾等方面仍需進一步的研究，以改善其分析性能、簡化其制備工藝、降低其使用成本，真正運用于實際監管與篩查工作中。

2.3 熒光蛋白標記材料

熒光蛋白最初來源于自然界，天然無毒，主要分為綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白3種類型[55]。熒光蛋白是一種新型熒光標記物，克服了傳統熒光標記物熒光背景高、易猝滅等缺點，不易受生物樣品自身熒光干擾，量子產率高，吸收帶譜寬，幾乎覆蓋所有可見光范圍，提高了熒光蛋白標記選擇的靈活性，目前已廣泛應用于免疫分析檢測領域[56]。

熒光蛋白與量子點等傳統熒光材料不同，它不需要任何化學修飾，簡化檢測步驟，更方便迅速。Riikka等[57]將伏馬菌素模擬體克隆為一種黃色熒光蛋白的融合蛋白，無需標記或二次抗體，可直接作為FB1檢測的示蹤劑，再結合AuNPs的熒光猝滅能力，可在一個步驟中進行均相免疫分析。得到FB1動態范圍為7.3～22.6 ng/mL，檢測限為1.1 ng/mL，IC50值為12.9 ng/mL，靈敏度較高，可用于檢測食品中霉菌毒素。王盛等[56]制備了一種檢測植物病毒煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的藻紅蛋白免疫熒光探針，其中應用的蛋白質交聯技術是藻膽蛋白熒光探針研制和應用的關鍵。如圖6，通過利用雙功能試劑SPDP在蛋白質分子中引入巰基，結合2-巰醇吡啶分析方法，定量測定引入活性基團比例，制得珊瑚藻R-藻紅蛋白（r-phycoerythrin,R-PE），再用珊瑚藻R-藻紅蛋白標記羊抗兔抗體，以硝酸纖維素膜為固相載體，用于煙草花葉病毒的檢測。

圖6 交聯反應流程[56]Fig.6 Crosslinking reaction process[56]

雖然熒光蛋白標記讓免疫檢測過程更便捷經濟，但其靈敏度低的問題也不容小覷。以生物素偶聯抗體或抗原，以親合素標記示蹤物，是免疫反應中通用的放大手段。為提高藻膽蛋白免疫熒光法檢測的靈敏度，吳萍等[58]引入橋式親合素-生物素系統（BRAB），通過將ELISA法與藻膽蛋白免疫熒光直接法、橋式BAS法相結合，利用橋式BAS的二級信號放大作用，最終得到血清中HBsAg的檢測率提高了1.5倍。當然，除了該方法之外，對反應條件的優化或是以惰性材料微球替代NC膜為固相載體進行富集反應，又或是采用雙抗體夾心法等也是提高檢測靈敏度的途徑[56]，還需進行進一步研究。

3 前景與展望

食品污染物中，除了常見的農藥、獸藥、真菌毒素、有害微生物等，更多新型污染物也在不斷產生。為對食品污染物進行快速、定量的低成本、大批量篩查，基于免疫分析技術建立了許多食品污染物的檢測方法。其中，膠體金免疫層析法發展較為成熟，但存在靈敏度不足、難以定量等問題。熒光免疫分析技術的高靈敏度很好地彌補了這些不足，符合免疫分析技術定量、快速、智能化的發展趨勢。熒光素是最先應用于熒光免疫分析技術的標記材料，但其穩定性和信號強度未能令人滿意。以特定載體材料將熒光素包裹成熒光微球是提高其穩定性和信號強度的一種解決方案；量子點、時間分辨熒光微球等標記材料的引入也改善了熒光免疫分析技術的穩定性和準確性。量子點熒光信號強而穩定，可實現多色標記；時間分辨熒光微球熒光壽命長，靈敏度高。上轉換發光納米材料、磁性熒光納米材料、熒光蛋白等新型標記物功能性較強，但其在成本、成熟性方面有待改善。基于熒光免疫分析技術的食品污染物檢測方法，其主要發展方向如下：

一是多重定量檢測。在實際檢測中，多種污染物往往同時存在于一種食品中（如多種真菌毒素同時存在于糧食中），需要進行多組分同時分析以提高效率。多色熒光微球和彩色量子點在多組分分析方面具有顯著優勢，以其作為標記物建立對特定食品基質的多組分分析檢測方法是一大發展趨勢。

二是新型標記材料的研發。研發新型標記材料是提高檢測結果準確性，實現定量、半定量分析的重要途徑。現有的新型標記材料往往成本較高，難以在現實檢測場景中得到廣泛應用，需要對其制備方法進行改良以降低成本；結合其他材料的特性，研制多功能復合材料也是新型標記物研發的重要方向，如磁性熒光材料將免疫磁分離與熒光免疫分析兩個步驟結合在一起，在提升檢測效果的同時大大簡化了檢測過程。

三是改善檢測環境和預處理方法。食品基質成分較為復雜，對熒光免疫分析造成了一定的干擾。改善檢測環境可以在一定程度上減弱基質帶來的干擾、提高檢測結果準確性；改良樣品預處理方法還可以使整個檢測過程更加便捷。

四是便攜式讀取儀器的研發和檢測方法智能化。多數商品化的熒光讀取儀器較為笨重，對操作者專業知識也有一定要求，并不適合現場篩查。進入信息化時代，不僅要實現讀取儀器便攜化，還要實現檢測過程自動化和檢測方法智能化。將熒光免疫分析技術更好地與信息技術結合起來，可以為食品污染物的日常篩查提供更有力的技術支持。