circ_0011460調控miR-145對子癇前期滋養細胞生物行為的影響

趙 丹，安 杰，劉 倩，李 力，朱清華

子癇前期(preeclampsia, PE)是一種常見的妊娠相關綜合征，以高血壓和蛋白尿為特征，是孕產婦和圍產兒死亡的主要原因。在正常妊娠期間，滋養細胞獲得類似腫瘤的特性并侵入子宮內膜和血管系統，這是胎盤形成、植入的關鍵步驟，然而PE胎盤中滋養層細胞未能正常侵入子宮[1]。因此，研究滋養層細胞遷移侵襲的分子機制，對了解PE發病機制及開發新的治療策略非常關鍵。環狀RNA(circRNA)是由前體RNA通過反向剪切形成的，具有共價閉合環結構的RNA分子，其通過與靶微小RNA(miRNA)結合、調節親本基因表達、與RNA結合蛋白相互作用等方式發揮生物學功能，在腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病、PE等疾病發生、進展中具有重要調控作用[2]。Deng等[3]通過RNA-Seq鑒定和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)證實，重度PE胎盤組織中circRNA 0011460(circ_0011460)表達上調，可能是該類患者潛在的治療靶點。靶基因預測顯示，miR-145是circ_0011460的潛在靶點。有研究指出，PE患者胎盤組織中miR-145表達降低，過表達miR-145可提高滋養細胞增殖率，降低細胞凋亡率[4]。因此，本研究假設circ_0011460可能靶向miR-145參與調控滋養細胞生物學行為；分析了circ_0011460、miR-145在正常胎盤、PE胎盤組織中表達，探討干擾circ_0011460表達對滋養細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并以miR-145為切入點探討其分子機制，旨在為PE治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月—2019年12月于本院行剖宮產的39例PE患者的胎盤組織為PE組。排除標準：原發性高血壓病、妊娠糖尿病、多胎妊娠、染色體異常、先天性畸形或懷疑圍產期感染的孕婦。并取同期在我院進行剖宮產的39例健康孕婦的正常胎盤組織為對照組(NC組)。2組均在剖宮產后10 min內獲得胎盤組織，切成1 cm3組織塊，保存于-80℃備用。該研究得到本院倫理委員會的批準。

1.2細胞和試劑 人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo細胞購于中國科學院上海細胞庫；PrimeScript逆轉錄Master Mix試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購于大連Takara公司；miRNA檢測試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；circ_0011460的小干擾RNA(si-circ_0011460)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、miR-145模擬物(miR-145)、miRNA模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-145抑制物(anti-miR-145)、miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、熒光素酶報告質粒均購自廣州銳博生物公司；雙重熒光素酶報告試劑盒購自北京全式金生物公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)購于上海弗元生物公司；包被基質膠Transwell小室購于北京優尼康公司；山羊抗兔IgG二抗(ab205718)、N-cadherin兔單克隆抗體(ab40772)、N-cadherin兔單克隆抗體(ab76011)、兔多克隆抗體(ab9485)均購于美國Abcam公司。

1.3RT-qPCR檢測circ_0011460和miR-145表達 TRIzol試劑提取2組胎盤組織總RNA，逆轉錄采用PrimeScript逆轉錄Master Mix試劑盒，然后采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒檢測circ_0011460進行RT-qPCR。利用miRNA檢測試劑盒對miR-145進行反轉錄和RT-qPCR。GAPDH作為circ_0011460的內參，U6作為miR-145的內參。2-ΔΔCt法計算circ_0011460和miR-145相對表達量。circ_0007611引物序列(上游5'-CTGGGGTGGTAAAACTTGGAGA-3'，下游5'-CTAATGTATTATAGCCCATATCCGG-3')；GAPDH(上游5'-ATCATCCCTGCCTCTACTGG-3'，下游5'-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3')；miR-145(上游5'-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3'，下游5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3')；U6(上游5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3')。

1.4細胞培養和實驗分組 將HTR-8/SVneo細胞在補充10%胎牛血清的RPMI 1640溶液中進行培養，該培養基補充有1%青霉素-鏈霉素雙抗，放入37℃、5%CO2中的培養箱中培養，當細胞達到70%～80%融合胰酶消化傳代。將對數期的HTR-8/SVneo細胞按照每孔3×105個接種于6孔板上，培養24 h后，利用Lipofectamine 3000將100 nmol/L的si-NC、si-circ_0011460、miR-NC、miR-145 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-145、si-circ_0011460+anti-miR-145分別轉染HTR-8/SVneo細胞，分為si-NC組、si-circ_0011460組、miR-NC組、miR-145組、anti-miR-NC組、anti-miR-145組、si-circ_0011460+anti-miR-145組。轉染48 h，RT-qPCR檢測轉染效果后進行后續實驗。

1.5雙熒光素酶報告實驗 Circular RNA Interaction數據庫預測到miR-145與circ_0011460存在特異性集合位點。將含有miR-145結合位點序列的circ_0011460野生型(wt)熒光素酶報告質粒wt-circ_0011460或突變型(mut)熒光素酶報告質粒mut-circ_0011460分別與miR-145 mimics、miR-NC共轉染HTR-8/SVneo細胞，48 h后采用雙重熒光素酶報告試劑盒檢測各組細胞相對熒光素酶活性。

1.6CCK-8法檢測細胞活力 將轉染48 h的細胞以5×103個/孔接種于96孔板，并分別培養24、48、72 h。然后，向每個孔中加入10 μl的CCK8溶液，然后在37℃下孵育1.5 h。使用酶標儀測量450 nm處的光密度(OD)值。

1.7劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 將轉染48 h細胞以1×105個/孔接種24孔板，37℃孵育過夜。用10 μl移液器槍頭尖端在細胞表面劃一直線。RPMI 1640培養基輕輕清洗漂浮細胞2次，顯微鏡下測量劃痕距離記為劃痕距離0 h，培養24 h后，顯微鏡下測量劃痕距離記為劃痕距離24 h，劃痕愈合率=(劃痕距離0 h-劃痕距離24 h)/劃痕距離0 h×100%。

1.8Transwell實驗檢測細胞侵襲 用無血清培養基將轉染48 h HTR-8/SVneo細胞密度調節至每毫升1×105個。將100 μl細胞懸浮液添加至Transwell室的上室，將500 μl包含20%胎牛血清的培養基添加至下室。培養箱孵育24 h，用棉簽除去Transwell膜上表面細胞和基質膠。用10%甲醛固定Transwell膜底部表面細胞10 min，0.1%結晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野細胞數均值表示細胞侵襲能力。

1.9蛋白免疫印跡檢測N-cadherin、E-cadherin蛋白表達 收集各組HTR-8/SVneo細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，加入RIPA裂解緩沖液獲得細胞總蛋白。制備12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每泳道上樣40 μg蛋白，90 V恒壓電泳分離蛋白，然后轉膜至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后吸盡封閉液。加入一抗溶液E-cadherin(1∶10 000)、N-cadherin(1∶5000)、GAPDH(1∶2500)在4℃下孵育過夜。用1∶2000稀釋的二抗室溫孵育2 h。通過化學發光檢測蛋白條帶，GAPDH作為內參，使用Image J軟件測定目的條帶的相對灰度值。

2 結果

2.1circ_0011460和miR-145在正常胎盤和PE胎盤組織中的表達水平及相關性 NC組和PE組的circ_0011460表達量分別為0.98±0.17、3.47±0.21，miR-145相對表達量分別為1.01±0.15、0.30±0.05。與NC組比較，PE組circ_0011460相對表達量顯著升高，miR-145相對表達量顯著降低(P<0.01)。circ_0011460與miR-145相對表達量呈負相關(r=-0.9547，P<0.01)。見圖1。

圖1 circ_0011460和miR-145在NC組和PE組胎盤組織中的表達及相關性

2.2不同處理HTR-8/SVneo細胞中circ_0011460和miR-145表達水平比較 HTR-8/SVneo細胞circ_0011460相對表達量分別為si-NC組1.00±0.00、si-circ_0011460組0.16±0.01。si-circ_0011460組circ_0011460相對表達量顯著低于si-NC組(P<0.01)。HTR-8/SVneo細胞miR-145相對表達量分別為miR-NC組1.00±0.00、miR-145組3.56±0.11、anti-miR-NC組1.00±0.00、anti-miR-145組0.27±0.02，miR-145組miR-145相對表達量顯著高于miR-NC組(P<0.01)。HTR-8/SVneo細胞miR-145相對表達量anti-miR-145組顯著低于anti-miR-NC組(P<0.01)。見圖2。

圖2 不同處理HTR-8/SVneo細胞中circ_0011460和miR-145表達水平比較

2.3circ_0011460和miR-145靶向關系的檢測 Circular RNA Interaction數據庫預測miR-145與circ_0011460存在特異性結合核苷酸序列。與si-NC組比較，si-circ_0011460組HTR-8/SVneo細胞miR-145表達水平顯著增加(P<0.05)，見圖3。同與wt-circ_0011460共轉染，miR-145組細胞相對熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低(P<0.01)。同與mut-circ_0011460共轉染，miR-145組細胞相對熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖3 circ_0011460和miR-145互補序列及circ_0011460對miR-145表達的影響

表1 轉染后miR-NC組與miR-145組HTR-8/SVneo細胞相對熒光素酶活性比較

2.4不同方法處理HTR-8/SVneo細胞活力及集落形成數比較 與si-NC組比較，si-circ_0011460組48、72 h的HTR-8/SVneo細胞活力、集落形成數顯著增加(P<0.01)；與miR-NC組比較，miR-145組48、72 h的HTR-8/SVneo細胞活力、集落形成數顯著增加(P<0.01)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-145組48、72 h的HTR-8/SVneo細胞活力、集落形成數顯著降低(P<0.01)；與si-circ_0011460組比較，si-circ_0011460+anti-miR-145組48、72 h的HTR-8/SVneo細胞活力、集落形成數顯著降低(P<0.05)。見圖4、5和表2。

表2 不同方法處理HTR-8/SVneo的細胞活性及集落形成數比較

圖4 不同方法處理HTR-8/SVneo細胞增殖比較

2.5不同處理HTR-8/SVneo遷移能力比較 與si-NC組比較，si-circ_0011460組HTR-8/SVneo細胞侵襲數、劃痕愈合率顯著增加(P<0.01)；與miR-NC組比較，miR-145組HTR-8/SVneo細胞侵襲數、劃痕愈合率顯著增加(P<0.01)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-145組HTR-8/SVneo細胞侵襲數、劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)；與si-circ_0011460組比較，si-circ_0011460+anti-miR-145組HTR-8/SVneo細胞侵襲數、劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)。見圖6、7和表3。

表3 不同處理HTR-8/SVneo細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數比較

圖5 不同方法處理HTR-8/SVneo細胞集落形成情況

圖6 不同處理HTR-8/SVneo細胞各時間點的劃痕愈合率

2.6不同處理HTR-8/SVneo細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達量比較 與si-NC組比較，si-circ_0011460組HTR-8/SVneo細胞E-cadherin蛋白表達量顯著降低，N-cadherin蛋白表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與miR-NC組比較，miR-145組HTR-8/SVneo細胞E-cadherin蛋白表達量顯著降低，N-cadherin蛋白表達量顯著增加，(P<0.01)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-145組HTR-8/SVneo細胞E-cadherin蛋白表達量顯著增加，N-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。與si-circ_0011460組比較，si-circ_0011460+anti-miR-145組HTR-8/SVneo細胞E-cadherin蛋白表達量顯著增加，N-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖7和表4。

表4 不同處理HTR-8/SVneo中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達量比較

圖7 不同處理HTR-8/SVneo中E-cadherin和N-cadherin蛋白免疫印跡圖

圖8 不同處理HTR-8/SVneo細胞侵襲細胞數的檢測(SP×400)

3 討論

PE作為臨床常見的妊娠并發癥，其影響全球3%～5%的孕婦，是胎兒發病和妊娠死亡的主要誘因，然而目前除早產或終止妊娠外，臨床尚缺乏有效的PE治療方法[5]。隨著對circRNA、miRNA等非編碼RNA作用的闡明，circRNA和miRNA在PE進展中的功能逐漸受到關注。Bai等[6]指出circ_0007021在PE和正常妊娠期間血漿中的表達存在差異，且這種差異可在妊娠20周之前檢測到，circ_0007021可能是一種新的PE生物標志物。Zhang等[7]研究證實PE胎盤組織中circHIPK3表達降低，circHIPK3低表達明顯抑制滋養細胞的遷移、侵襲、增殖和成管能力。Liu等[8]發現miR-34a通過Notch信號調控PE患者胎盤滋養細胞的侵襲。

本研究結果顯示，circ_0011460在PE胎盤組織中表達增加，這與既往文獻報道基本吻合[5]。本研究結果顯示，PE胎盤組織中miR-145相對表達量減少，且circ_0011460和miR-145相對表達量呈負相關。本研究結果同時顯示，miR-145是circ_0011460的靶基因，且circ_0011460對miR-145具有靶向負調控作用，提示circ_0011460可能靶向miR-145參與調控PE進展。

本研究結果顯示，干擾circ_0011460可增加HTR-8/SVneo細胞活力、克隆形成、遷移和侵襲能力；過表達miR-145亦可促進HTR-8/SVneo增殖、遷移和侵襲，這與Lv等[9]研究結論一致。然而，在胃癌等多種腫瘤細胞系中miR-145表達降低，上調miR-145通過靶向多種致癌基因可抑制腫瘤轉移，具有抑癌作用[10-11]。此外，miR-145介導沉默circWHSC1對卵巢癌細胞惡性行為的抑制作用，這可能與miR-145的組織特異性表達模式有關[12]。本研究結果顯示，抑制miR-145表達顯著逆轉干擾circ_0011460對HTR-8/SVneo增殖、遷移和侵襲的促進作用，這進一步證實circ_0011460靶向miR-145調控HTR-8/SVneo細胞生物學行為。然而，miR-145的下游靶點仍需進一步確認。

上皮間充質轉化(EMT)是上皮細胞獲得遷移和侵襲能力并轉化間質細胞的過程，在妊娠期間滋養細胞通過EMT獲得遷移、侵襲能力并侵入子宮內膜以重塑螺旋動脈，而滋養細胞的遷移和侵襲不足導致胎盤功能障礙[13]。E-cadherin和N-cadherin分別是上皮表型和間質表型標志蛋白，研究指出PE胎盤組織中E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低，去甲基化酶Alk B同源蛋白5(ALKBH5)、circ_0007121通過調節E-cadherin和N-cadherin蛋白表達可改變PE滋養細胞遷移和侵襲表型[14]。本研究結果顯示，干擾circ_0011460或過表達miR-145均可下調E-cadherin蛋白表達量，上調N-cadherin蛋白表達量，這提示干擾circ_0011460或過表達miR-145可能通過誘導上皮-間質轉化發揮促遷移、促侵襲作用。此外，抑制miR-145表達明顯減弱干擾circ_0011460對HTR-8/SVneo細胞中N-cadherin、E-cadherin蛋白表達量的影響，這進一步證實circ_0011460靶向miR-145調控HTR-8/SVneo細胞遷移和侵襲。

綜上所述，干擾circ_0011460通過靶向上調miR-145可促進PE滋養細胞增殖、遷移和侵襲，這為進一步了解PE發病機制提供了新的見解，為臨床治療PE提供了新的思路。