右美托咪定對神經膠質瘤細胞PTEN/Akt/mTOR介導自噬及放療敏感性的影響

彭 湃，楊 軍，羅 琴，邱 勇

神經膠質瘤是常見的顱內惡性腫瘤，易擴散至腦組織，具有高度異質性和侵襲性，單純手術難以根治性切除，放化療成為其常見治療方式；但放療不敏感可導致局部放療失敗，因此，研究神經膠質瘤放療不敏感機制，尋找提高放療敏感性藥物對該病的治療具有重要意義[1-2]。右美托咪定(DEX)是一種α2-腎上腺受體激動劑，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等生物學活性作用[3]。蔡明林等[4]報道，DEX可抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移, 作用機制可能與抑制第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路激活有關，但DEX對神經膠質瘤細胞的放療不敏感作用機制尚不清楚。

自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑，在參與細胞生長分化、維持細胞內環境穩定等過程中發揮重要作用。研究表明，激活腫瘤細胞自噬，可增強腫瘤細胞放療敏感性[5]。PTEN/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路對腫瘤細胞增殖、遷移、自噬、放療耐受等具有重要作用[6-7]。楊永祥等[8]報道，抑制PTEN的表達，Akt、mTOR的磷酸化水平升高，可增加創傷性腦損傷大鼠海馬區神經干細胞增殖能力，表明PTEN/Akt/mTOR信號通路與神經細胞的增殖有關。本研究探究了DEX對神經膠質瘤U251細胞自噬與放療敏感性影響，明確分子作用機制，旨在為神經膠質瘤的放療增敏提供一定參考。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、試劑及儀器 神經膠質瘤U251細胞(批號XLD-2020013)購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所；DEX(批號090119，規格2 ml:0.2 mg)購自江蘇恩華藥業股份有限公司；二甲基亞砜(DMSO，批號D8371)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(批號CA1027)、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒(批號F5013)均購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養液(批號G1037)、胎牛血清(批號G6113)均購自美國Gibco公司；BCA試劑盒(批號P0042)、ECL試劑盒(批號ST1297-10)、RIPA裂解液(批號P0125F)、硝酸纖維素膜(批號SF1917)均購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗人微管相關蛋白1輕鏈3(LC3，批號sc-430752)、自噬相關蛋白(Beclin-1，批號sc-141273)、PTEN(批號sc-305572)、Akt(批號sc-20983)、p-Akt，(批號sc-20987)、mTOR(批號sc-713395)、p-mTOR(批號sc-713340)、β-肌動蛋白(β-actin，批號sc-11004)抗體及兔抗人二抗(批號sc-10007)均購自美國Santa Cruz公司；371型二氧化碳(CO2)恒溫培養箱、Multiskan GO型酶標儀和E-Gel Imager型凝膠成像儀均購自美國Thermo公司；FACSCantoⅡ型流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司。

1.2細胞培養 將神經膠質瘤U251細胞活化后，用含有10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素各1×105U/L的DMEM培養液，在37℃恒溫、5% CO2培養箱中培養，隔天換液1次，待80%細胞貼壁融合時，0.25%胰酶消化，取對數期細胞進行后續實驗。

1.3MTT法檢測DEX對細胞增殖的影響 取對數生長期U251細胞，調整細胞濃度為每毫升2×106個，將細胞接種于96孔板中，培養過夜，分別加入終濃度為5、10、25、50、100、200、500 ng/ml的DEX，另設對照組(不加DEX處理)，每組均設6個復孔，繼續培養24、48 h。每孔加入20 μl的MTT溶液(濃度為0.5 mg/L)，培養4 h后，加入200 μl的DMSO，用全自動酶標儀測量490 nm處的光密度(OD)值。

1.4細胞放療處理 將培養板置于照射野(20 cm×20 cm)內，細胞板上放置1.5 cm硅膠補償膜，采用6 MV直線加速器X射線進行照射，直線加速器6 MV-X線照射，吸收劑量率為250 cGy/min，總照射劑量分別為 0、2、4、6、8 Gy。

1.5克隆形成實驗 放療組給予0、2、4、6、8 Gy劑量的X射線照射處理；DEX+放療組給予10 ng/ml DEX和0、2、4、6、8 Gy劑量的X射線照射處理。DEX+放療組在照射前采用DEX培養48 h，放射處理后，更換新鮮培養液，繼續培養10 d，每3天更換培養基，觀察克隆形成情況，當培養板中出現集落形成時，棄去培養液，PBS緩沖液洗滌，多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，計算細胞克隆形成率，克隆形成率=(菌落形成數/接種細胞數)×100%。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 實驗分為對照組、放療組(6 Gy劑量射線處理)、DEX組(10 ng/ml DEX處理)、DEX+放療組(10 ng/ml DEX+6 Gy劑量射線聯合處理)。細胞照射前采用10 ng/ml DEX培養48 h，再用6 Gy劑量的X射線照射處理，各組細胞培養 48 h，采用Annexin V-FITC 和PI溶液避光染色10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7蛋白免疫印跡法檢測細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1及PTEN/Akt/mTOR通路相關蛋白的表達 按照1.6的分組，細胞培養48 h后，4℃條件下加RIPA裂解液處理各組細胞，抽提總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量，取50 μg蛋白并加入5×上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min，-20℃保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠上的目的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入一抗(LC3、Beclin-1、PTEN、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin)(稀釋比均為1∶1000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶3000)，室溫孵育2 h，PBS緩沖液洗滌，ECL顯影液顯色，用凝膠成像系統拍照并分析各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1DEX對U251細胞增殖的影響 與DEX濃度0 ng/ml時比較，5、10、25、50、100、200、500 ng/ml DEX處理U251細胞24、48 h的OD值均降低(P<0.05)。經計算DEX處理U251細胞24 h半數抑制濃度(IC50)約為50 ng/ml，后續實驗采用20%×IC50為研究濃度，即10 ng/ml。見表1。

表1 不同濃度DEX處理后U251細胞不同時間點的OD值比較

2.2DEX對U251細胞放療克隆形成率的影響 與放療組0 Gy時比較，放射劑量2、4、6、8 Gy時U251細胞克隆形成率明顯降低，且與放療劑量增加相關(P<0.05)。與 DEX+放療組0 Gy比較，放射劑量2、4、6、8 Gy的U251細胞克隆形成率明顯降低，且與放療劑量增加相關(P<0.05)。DEX+放療組各放射劑量U251細胞克隆形成率均低于放療組同劑量，其中10 ng/ml DEX和6 Gy放射劑量聯用后，能夠明顯增加對U251細胞的放療敏感性(P<0.05)。見表2。因此，本研究采用10 ng/ml的DEX與6 Gy放射劑量聯合處理進行后續實驗。

表2 DEX對U251細胞放療克隆形成率影響

2.3DEX對U251細胞放療凋亡的影響 4組細胞凋亡率分別為：對照組(3.63±0.09)%、放療組(15.64±1.58)%、DEX組(24.32±1.69)%、DEX+放療組(36.35±2.18)%。放療組細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)；DEX+放療組細胞凋亡率高于放療組(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測4組U251細胞凋亡情況

2.4DEX對自噬蛋白LC3、Beclin-1蛋白表達的影響 與對照組比較，放療組、DEX組和DEX+放療組LC3、Beclin-1蛋白表達水平均升高(P<0.05)；與放療組比較，DEX+放療組LC3、Beclin-1蛋白表達水平均升高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 4組細胞LC3、Beclin-1蛋白免疫印跡圖

表3 DEX對U251細胞自噬蛋白LC3、Beclin-1蛋白表達的影響

2.5DEX對神經膠質瘤細胞PTEN/Akt/mTOR通路相關蛋白的影響 與對照組比較，放療組、DEX組和DEX+放療組PTEN蛋白水平升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。與放療組比較，DEX+放療組PTEN蛋白水平升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 4組神經膠質瘤細胞PTEN/Akt/mTOR通路相關蛋白免疫印跡圖

表4 DEX對神經膠質瘤細胞PTEN/Akt/mTOR通路相關蛋白的影響

3 討論

DEX具有鎮靜、鎮痛、抗焦慮、抗交感及減弱應激等多重作用，臨床上常用于神經系統的鎮定[9]。近年研究表明，DEX能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移，誘導細胞凋亡[10]。本研究結果顯示，5～500 ng/ml的DEX對神經膠質瘤U251細胞的增殖均有抑制作用，且隨DEX濃度增大，對U251細胞抑制作用增強，經計算DEX對U251細胞IC50約為50 ng/ml。文獻報道，放射增敏劑較小劑量即有放射增敏的作用，但增敏劑本身對腫瘤組織作用不強[11]，因此選用IC50的20%進行增敏實驗。本試驗發現，分別使用放射劑量為2、4、6、8 Gy的X射線處理U251細胞后，細胞克隆形成率降低，與DEX聯合處理后，U251細胞克隆形成率明顯降低；與放療組比較，DEX與6 Gy放射劑量聯合處理，細胞克隆形成率明顯降低，細胞凋亡率增加，能夠明顯增加對U251細胞的放療敏感性，然而其具體作用機制尚不清楚。

自噬廣泛存在于真核生物中，維持細胞內穩態和生長發育，對腫瘤細胞有雙刃劍的作用，具有促存活及凋亡的作用，并且能夠影響腫瘤的抗放療損傷能力[12]。LC3是自噬小體標志蛋白，Beclin-1 是抑癌基因表達的產物，二者均是自噬相關標志物[13-14]。本研究結果顯示，與對照組比較，放療組LC3、Beclin-1蛋白水平均顯著升高，提示放療能誘導U251細胞的自噬；與放療組比較，DEX+放療組LC3、Beclin-1蛋白水平均顯著升高，提示DEX可增加放療對神經膠質瘤細胞自噬作用。

PI3K/Akt通路是細胞內重要的信號傳導通路，PTEN通過調控PI3K/Akt通路去磷酸化，發揮抑制腫瘤的功能[15]。Akt/mTOR通路是調控自噬的經典通路，mTOR是一種自噬激活劑，抑制mTOR途徑可激活自噬，Akt是其上游的調控分子，Akt磷酸化可激活下游通路[16-17]。研究表明，在放射低敏感性食管鱗狀細胞癌中，抑制Akt的磷酸化，可增加腫瘤細胞放療敏感性[18]。何娟等[19]報道DEX能夠抑制膠質瘤細胞內Akt信號通路抑制膠質瘤細胞U251體外惡性生長和侵襲。本研究結果顯示，與對照組比較，放療組PTEN蛋白水平顯著升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均顯著降低；與放療組比較，DEX+放療組PTEN蛋白水平顯著升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均顯著降低，提示DEX與放療聯合作用時可抑制PTEN/Akt/mTOR信號通路的活化。

綜上所述，DEX可能通過抑制PTEN/Akt/mTOR通路，誘導神經膠質瘤U251細胞發生自噬，增加U251細胞放療的敏感性。