柚皮素上調(diào)鋅指蛋白36表達(dá)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖、侵襲的影響

李文建， 陳 坤

近年，下咽癌發(fā)病率有明顯升高趨勢(shì)，約占頭頸部腫瘤的5%，主要以鱗狀細(xì)胞癌為主[1]。手術(shù)切除聯(lián)合藥物化療或放療是下咽癌當(dāng)前最為有效的治療手段。但下咽癌結(jié)構(gòu)特殊，發(fā)病隱匿且具有高侵襲性，更易局部侵襲并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，5年生存率為25%～35%[2-3]。如何控制癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，是有效降低病死率的關(guān)鍵。

鋅指蛋白36(ZFP36)可以控制信使RNA 3' 端非翻譯區(qū)的ARE活性，從而影響信使RNA的穩(wěn)定及蛋白質(zhì)的表達(dá)；其作為一種調(diào)控因子，具有原癌基因或抑癌基因作用，可影響細(xì)胞的生物學(xué)特性；與胃癌、結(jié)腸癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。柚皮素是一種廣泛分布在水果、蔬菜和茶中黃酮類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗凋亡等生物學(xué)活性。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[5]。癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種信號(hào)通路異常。STAT3信號(hào)通路與多種癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲密切相關(guān)。本研究探討柚皮素對(duì)ZFP36蛋白、STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白及對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖、侵襲等影響，以期為改善下咽癌臨床治療提供理論基礎(chǔ)及潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 下咽癌FaDu細(xì)胞株(購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái))；青鏈霉素(索來(lái)寶公司)；RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；小牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；柚皮素、二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；脂質(zhì)體2000(美國(guó)賽默飛公司)；Trizol RNA抽提試劑、Rime ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaTM熒光定量PCR 試劑盒(日本Takara 公司)；E-cadherin、vimentin、轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)單抗(美國(guó)Cell Signaling公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；7500型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將FaDu細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件，終濃度為10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2.2FaDu細(xì)胞增殖能力測(cè)定：將培養(yǎng)的FaDu細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的柚皮素處理FaDu細(xì)胞48 h，按每孔10 μl加入CCK-8試劑，37℃、5% CO2條件下孵育2～4 h，450 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3FaDu細(xì)胞侵襲能力測(cè)定：按照1∶8比例稀釋基質(zhì)膠，包被到Transwell小室底部膜上室面，分別將終濃度為0、10、20、40 μmol/L的柚皮素處理的FaDu細(xì)胞加入到Transwell小室，細(xì)胞終濃度為5×104個(gè)/ml，然后板下室加入含20%小牛血清的培養(yǎng)液600 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 20～24 h。取出Transwell 小室，經(jīng)過(guò)固定、染色、分化、再染色、脫水及封片，在200倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.4ZFP36+PCR3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后FaDu細(xì)胞增殖、侵襲能力測(cè)定：待FaDu細(xì)胞達(dá)到 30%～50%的融合率時(shí)，按照脂質(zhì)體2000試劑盒操作步驟，將ZFP36+PCR3.1質(zhì)粒、PCR3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入FaDu細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖和侵襲能力。將細(xì)胞分為對(duì)照組、PCR3.1質(zhì)粒組和ZFP36+PCR3.1質(zhì)粒組。

1.2.5基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9和MMP-13 mRNA表達(dá)情況：采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。將ZFP36+PCR3.1質(zhì)粒、PCR3.1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入FaDu細(xì)胞后，吸去培養(yǎng)液后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每孔各加入1 ml TRIzol 試劑，反復(fù)吹打細(xì)胞，移入去酶EP管中，按照TRIzol試劑盒使用說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照 TaKaRa試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，過(guò)程按照 TaKaRa試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)條件按照TaKaRa試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)相對(duì)定量ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.6EMT相關(guān)蛋白及STAT3信號(hào)通路表達(dá)情況：采用Western blot檢測(cè)，將ZFP36+PCR3.1、PCR3.1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入FaDu細(xì)胞后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集到EP管中，加入預(yù)冷蛋白裂解液提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量。隨后將蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離，再以300 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入E-cadherin、vimentin、STAT3、SOCS3等一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日1×TBS-T洗滌3次，每次5 min，加入辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，再1×TBS-T洗滌3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1柚皮素對(duì)FaDu細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響 不同濃度柚皮素處理FaDu細(xì)胞48 h后，隨著柚皮素濃度增加，細(xì)胞增殖活性顯著下降，細(xì)胞侵過(guò)濾膜的數(shù)量顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同濃度柚皮素培養(yǎng)條件下FaDu細(xì)胞增殖能力

圖2 不同濃度柚皮素培養(yǎng)條件下FaDu細(xì)胞侵襲能力(HE×200)

2.2柚皮素對(duì)ZFP36蛋白表達(dá)的影響 隨著柚皮素濃度增加，ZFP36蛋白表達(dá)水平增加，且呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度柚皮素對(duì)ZFP36蛋白表達(dá)影響

2.3ZFP36對(duì)FaDu細(xì)胞增殖、侵襲能力和MMP基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組和PCR3.1組比較，ZFP36+PCR3.1組FaDu細(xì)胞增殖活性、侵襲能力、MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4～6。

圖4 ZFP36+PCR3.1轉(zhuǎn)染后FaDu細(xì)胞增殖能力比較

圖5 轉(zhuǎn)染ZFP36+PCR3.1后FaDU細(xì)胞侵襲能力(HE×200)

圖6 轉(zhuǎn)染ZFP36+PCR3.1后FaDu細(xì)胞MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)情況比較

2.4ZFP36對(duì)EMT相關(guān)蛋白及信號(hào)通路表達(dá)的影響 與對(duì)照組和PCR3.1組比較，ZFP36+PCR3.1組E-cadherin、SOCS3表達(dá)上升，vimentin、STAT3表達(dá)水平均下降(P<0.05)。見(jiàn)圖7、8。

圖7 轉(zhuǎn)染ZFP36+PCR3.1后FaDU細(xì)胞對(duì)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

圖8 轉(zhuǎn)染ZFP36+PCR3.1后FaDU細(xì)胞對(duì)STAT3和SOCS3蛋白表達(dá)水平影響

3 討論

約50%下咽癌患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[6]。如何有效地控制癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，成為臨床醫(yī)生面對(duì)的難題。本研究結(jié)果顯示，柚皮素可以抑制下咽癌FaDu細(xì)胞增殖、侵襲，且呈劑量依賴(lài)性。提示柚皮素可用于下咽癌的輔助治療。本研究結(jié)果顯示，隨著柚皮素濃度增加，在FaDu細(xì)胞中ZFP36蛋白表達(dá)上調(diào)。柚皮素抑制FaDu細(xì)胞增殖、侵襲可能與ZFP36蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，提示ZFP36可能是一種新型柚皮素靶點(diǎn)。ZFP36參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[7]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的生物學(xué)作用。Lee等[8]報(bào)道，ZFP36在結(jié)腸癌細(xì)胞CT26中調(diào)控白細(xì)胞介素-23 mRNA的表達(dá)，ZFP36過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Resch等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ZFP36調(diào)控宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖和凋亡。本課題組將ZFP36+PCR3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入FaDu細(xì)胞中后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、侵襲被明顯抑制，表明ZFP36基因可能是下咽癌細(xì)胞增殖、侵襲的關(guān)鍵基因。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一種蛋白酶家族，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9等蛋白酶，可靶向其他蛋白、生長(zhǎng)因子及黏附分子[10]。MMP-9和MMP-13高表達(dá)與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性。Nair等[10]研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)MMP-14促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ZFP36使MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)水平下降，從而抑制FaDu細(xì)胞的增殖和侵襲。

EMT在腫瘤發(fā)生過(guò)程中也起著重要作用，包括局部侵襲和通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[11]；其顯著特征為細(xì)胞間黏附分子和E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而N-cadherin、vimentin和黏連蛋白表達(dá)上調(diào)。E-cadherin和vimentin在腫瘤組織的侵襲和遷移中起著重要作用[12]。在下咽癌中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)與癌細(xì)胞的侵襲、遷移和預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)FaDu細(xì)胞中ZFP36過(guò)表達(dá)時(shí)，vimentin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)則上調(diào)。同時(shí)柚皮素上調(diào)ZFP36蛋白表達(dá)與STAT3信號(hào)通路有關(guān)，過(guò)表達(dá)ZFP36導(dǎo)致STAT3表達(dá)顯著下降。在正常組織中，STAT3蛋白活化為短暫性、可逆性激活，SOCS3通過(guò)負(fù)反饋抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使活化的STAT3迅速恢復(fù)正常狀態(tài)[13]。在腫瘤組織中，SOCS3蛋白表達(dá)異常導(dǎo)致STAT3持續(xù)性活化、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。SOCS3是抑制STAT3的內(nèi)源性基因，其通過(guò)結(jié)合磷酸酪氨酸殘基SH2區(qū)域或者細(xì)胞因子受體來(lái)抑制STAT3信號(hào)通路[14]。陳宇斐等[15]報(bào)道，MCF-7細(xì)胞中STAT3蛋白改變，是由于其上游蛋白JAK抑制所導(dǎo)致的。本研究結(jié)果顯示，在FaDu細(xì)胞中，ZFP36可抑制STAT3磷酸化，并上調(diào)SOCS3蛋白的表達(dá)水平。提示在下咽癌FaDu細(xì)胞中，柚皮素誘導(dǎo)的ZFP36蛋白可促進(jìn)SOCS3表達(dá)并抑制STAT3活性。

綜上所述，柚皮素可抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖、侵襲，其通過(guò)上調(diào)ZFP36表達(dá)改變FaDu細(xì)胞生物活性。ZFP36可增加SOCS3蛋白表達(dá)，下調(diào)STAT3表達(dá)，為臨床治療下咽癌提供了理論基礎(chǔ)。