GFI1B在急性髓系白血病中表達及對臨床療效的評估

張志敏，劉鑫艷，張永梅，潘志蘭，周 潔，林鳳茹

獨立生長因子1B(growth factor-independent 1B， GFI1B)是一種核轉錄抑制因子，位于人類基因組9q34.13[1]。GFI1B基因主要表達于胎兒、成人的紅系和巨核系，是兩系生成和分化過程中一種必需的轉錄因子，故其表達水平的高低與急性白血病、T細胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等血液系統疾病密切相關[2]。急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是髓系造血干/祖細胞惡性疾病，以骨髓和外周血中原始和幼稚髓細胞異常增生為特征[3]。目前有關GFI1B基因在AML中的表達規律及其與患者臨床特征之間的關系報道較少[4]，本研究通過分析AML患者GFI1B表達及與其病情、預后的關系，以期研究GFI1B的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析2018年5月—2020年3月本院收治的AML患者的臨床資料。納入標準：均由臨床、血常規、骨髓象確診為AML[5]；病例資料完整；年齡<80歲。排除標準：合并其他血液系統疾病者；合并心、肝、腎等器官和系統嚴重疾病或惡性腫瘤者；妊娠期和哺乳期女性、精神障礙者。根據納入排除標準最終納入106例AML為觀察組，男61例，女45例；年齡26～78(43.52±5.73)歲；AML類型：M1型28例、M2型22例、M5型21例、M4型20例、M6型10例，M7型5例；另選取同期在本院進行體檢的健康者100例為對照組，男性51例，女性49例；年齡27～77(43.54±5.78)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1檢測儀器及試劑：以實時熒光定量PCR儀(PQ-PCR)及超敏CRP檢測儀(PQ-CRP)檢測GFI1B mRNA的表達并進行動態觀察，熒光分析儀(ABI-5700)購自美國PE公司，PQ-PCR引物合成、熒光探針合成、PQ-PCR用dNTP、5×PQ-PCRbuffer購自廣東達安臨床檢驗中心，PCR引物合成購自北京賽百盛公司。

1.2.2檢測方法：①細胞分離、總RNA提取：抽取2組新鮮外周血4 ml，肝素(107 U/L)抗凝，加Ficoll淋巴細胞分離液4 ml，離心(2000 r/min)20 min分離出單個核細胞，0.9%氯化鈉注射液洗滌3次。采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取細胞總RNA，1 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀顯示28 S和18 S兩條清晰的條帶，顯示提取完整的RNA。②cDNA的合成：逆轉錄體系20 μl，包括細胞總RNA 1 μg，隨機引物500 ng，RNA酶抑制劑25 U，5×逆轉錄反應緩沖液4 μl，MMLV逆轉錄酶200 U。37℃、60 min，94℃、5 min，1℃、2 min終止反應。③GFI1B正向引物：5'-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3'，GFI1B反向引物：5'-CCGGCTCTCGTTTGAGGTT-3'，GFI1B探針序列：5'-FAM-CCGGTGCCCAGAGACCAGGC-TAMRA-3'GFI1B擴增片段長度為117 bp。④RQ-PCR反應：待測樣本和陽性標準品按以下反應體系進行：反應體系50 μl，包括5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F(10 pmol/μl)1 μl，下游引物R(10 pmol/μl)1 μl，探針(5 pmol/μl)1 μl，dNTPs(10 mmol/L)1 μl，Taq酶(3 U/μl)1μl，cDNA或陽性標準品1 μl，ddH2O34 μl。擴增條件為：93℃、3 min，然后93℃、30 s，55℃、45 s，共40循環。⑤產物的定量分析：反應結束后，任選4～5個陽性模板標準梯度點分析，若相關系數r2>0.97，表明線性關系良好，可確定為定量標準曲線，根據標準曲線得出樣本熒光定量反應的絕對定量值，即為目的基因的表達水平。

1.2.3療效判斷：參考《血液病診斷及療效標準》(第4版)評估。①完全緩解(CR)：臨床無白血病細胞浸潤的癥狀和體征；血紅蛋白≥100 g/L(男性)或≥90 g/L(女性)，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血無白血病細胞；骨髓中原始細胞≤5%。②部分緩解(PR)：骨髓中原始細胞5%～20%，或臨床、血常規中有一項未達到CR標準。③未緩解(NR)：骨髓象、血常規及臨床表現未達上述標準。

1.2.4復發難治白血病診斷標準[6]：①復發性AML定義為CR后外周血再次出現白血病細胞或骨髓中原始細胞>5%(除鞏固化療后骨髓再生等其他原因外)或出現白血病髓外浸潤。②難治性AML:經過標準誘導治療2個療程后未達到CR的初診患者；CR后經過鞏固強化治療6個月內復發者；6個月后復發但經常規化療無效者；2次或多次復發者；髓外白血病持續存在者。

1.3隨訪方法 觀察組進行為期6個月的隨訪，隨訪方式包括電話隨訪、門診復查[7]；隨訪截止時間為2020年9月，了解預后情況。

2 結果

2.1GFI1B表達水平比較 2組GFI1B表達水平分別為觀察組(0.76±0.12)×106拷貝/μl cDNA、對照組(0.06±0.01)×106拷貝/μl cDNA。觀察組GFI1B表達水平高于對照組(P<0.01)。

2.2CR、PR及難治復發的AML患者GFI1B表達比較 經化療后，CR 30例，PR 49例，難治復發27例。CR AML患者治療前后GFI1B的表達水平分別為(0.75±0.14)×106拷貝/μl cDNA、(0.13±0.02)×106拷貝/μl cDNA，PR AML患者治療前后GFI1B的表達水平分別為(0.78±0.11)×106拷貝/μl cDNA、(0.42±0.09)×106拷貝/μl cDNA，難治復發AML患者治療前后GFI1B表達水平分別為(0.74±0.16)×106拷貝/μl cDNA、(0.78±0.15)×106拷貝/μl cDNA。與治療前比較，CR和PR AML患者治療后GFI1B表達水平顯著降低，且CR患者低于PR和難治AML復發者，PR AML患者低于難治復發AML患者(P<0.05，P<0.01)。難治復發AML患者治療前后GFI1B表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3觀察組預后情況 截至隨訪結束，觀察組106例中生存61例、死亡45例，生存率57.55%，病死率為42.45%。

2.4單因素分析 年齡、性別與AML患者預后生存無關(P>0.05)，白細胞水平、髓外浸潤、危險度分型、達CR所需療程數、查爾森合并癥指數(CCI)評分及GFI1B表達水平為AML患者預后生存的危險因素(P<0.05)。見表1。

表1 影響AML預后生存的單因素分析[例(%)]

2.5多因素分析 經非條件多因素Logistic回歸模型分析得，有髓外浸潤、CCI評分≥2分及GFI1B表達≥0.5×106拷貝/μl cDNA是影響AML患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響AML預后生存多因素Logistic回歸分析

3 討論

AML初始的標準誘導化療方案可使緩解率達50%以上[7]。但仍有部分患者終將復發，一旦復發病死率顯著增加。年齡、髓外浸潤、CCI評分、白細胞水平、免疫分型等均對AML預后存在一定影響[8]。本研究結果顯示，髓外浸潤、CCI評分是影響預后生存的獨立危險因素，與既往研究一致[9]。國內外學者發現了一批與腫瘤發生、發展和預后相關的基因，針對癌基因的分子靶向治療也取得重要進展[10]。AML是造血干細胞的異常增殖和成熟障礙所致，且是一個多步驟多基因參與的過程，因此該病發生的第一步往往是由于控制細胞生長的基因表達異常或其編碼蛋白功能異常[11]。調控細胞轉化最常見的一類基因是以轉錄因子形式起作用，最終導致細胞轉錄調控異常，GF正是這類基因[12]。1993年，Gilks等在大鼠T細胞淋巴瘤的MOMULV的整合位點上第一次發現了GFl1基因[13]。GFI1B是GFI1家族的成員之一，研究發現，GFI1B可加速T細胞淋巴瘤的發展；同時由于GFI1B也表達于造血干細胞，其對維持造血干細胞的自我更新活性及功能完整性尤為重要[14]。此外，近年基因打靶實驗揭示了GFI1B在中性粒細胞分化中也發揮著重要作用。

動物研究顯示，GFI1B缺乏的小鼠不能生成成熟的紅細胞，而在這些小鼠的肝臟中紅系和巨核系生成的前體物質增多，這表明GFI1B在紅系和巨核系的生成和分化中起了重要的作用，并且GFI1B在造血干細胞中表達，以不依賴與紅細胞生成素的方式誘導紅系的生成[1,15-16]。2006年Ahmet等首次報道了GFI1B在急性白血病中呈現高水平表達，尤其是在AML患者中表達顯著增高[17-18]。本研究結果顯示，觀察組GFI1B表達水平高于對照組，同時在療效滿意AML患者中GFI1B水平呈下降趨勢，這與既往結果一致。有力地佐證了GFI1B可參與AML的發生，并可為臨床療效評估提供了有效依據。有研究認為GFI1B基因不僅能夠誘導細胞周期依賴激酶抑制物p2l Wafl/Cip的產生和表達，使細胞滯留在G0期，還能與GFl1基因相互作用使細胞癌變，故GFI1B基因表達水平高的AML病死率較高[19-20]。本研究結果顯示，GFI1B表達是影響AML預后生存的獨立危險因素，這提示進行GFI1B基因的監測對AML預后有著重要的指導意義。

綜上所述，GFI1B在AML患者中呈高表達狀態，其表達異常升高者預后死亡風險更高，臨床可加強對AML患者GFI1B的動態監測，以提高生存率。本研究不足之處在于納入病例數較少，未來需擴大病例數進一步驗證。