磷限制對(duì)三角褐指藻脂質(zhì)含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響

朱文娜 龔一富 郭芮棟 楊 雨 蔡嘉碩 王何瑜 汪 如

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院1，寧波 315832)(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院2，寧波 315832)

微藻是一類結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速的單細(xì)胞光合自養(yǎng)藻類。它們可以通過固定大氣中CO2在全球生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色[1]。由于微藻內(nèi)含有維生素、氨基酸和某些次生代謝產(chǎn)物，使其在醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)大受青睞[2,3,4]。近年來，化石燃料的日益減少和人類環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，人們開始緊急地尋找可替代化石燃料的新能源。微藻被認(rèn)為是替代化石燃料的理想來源。微藻油脂中的甘油三酯可用于不同的生物燃料的生產(chǎn)，包括生物柴油、生物合成氣、生物油和生物氫[5]。微藻中的不飽和脂肪酸具有調(diào)節(jié)人體生理健康的多種功能，如改善炎癥水平、促進(jìn)大腦和視力發(fā)育、緩解代謝類疾病、預(yù)防心臟類疾病和抗氧化作用等[6]，所以如何高效生產(chǎn)微藻油脂受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

磷是生物體必需的大量元素之一，能夠用于合成DNA、ATP、磷脂等生命活動(dòng)所必需的重要細(xì)胞物質(zhì)，并參與眾多的新陳代謝反應(yīng)[7]。磷元素還是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的一部分，在物質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等方面承擔(dān)重要角色[8]。Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)磷元素可以緩解鋁脅迫對(duì)柑橘(Citrusgrandis)幼苗的生長和光合抑制。還有大量的研究表示磷對(duì)脂質(zhì)的影響較大。合適的磷酸鹽濃度可顯著提高紫菜(Porphyridiumpurpureum)的總脂肪酸(TFA)和花生四烯酸(ARA)的生物量，隨著磷酸鹽濃度的持續(xù)下降，UFA/TFA和ARA/EPA的比例也相應(yīng)增加[10]。Canavate等[11]指出海洋浮游植物已經(jīng)發(fā)展出一種多樣化的機(jī)制，可以在磷的影響下重塑其脂質(zhì)類別。Yu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，磷的缺乏也促進(jìn)了微藻生物量中脂肪酸(FA)的含量增加。

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)是一種重要的海洋微藻，是研究海洋微藻的模式物種。三角褐指藻生長迅速，能高度適應(yīng)溫度、鹽度、光照強(qiáng)度和酸堿度。它可以在沒有硅的情況下生存且是易于高密度培養(yǎng)的藻種[13]。三角褐指藻細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸含量比較高，脂質(zhì)存儲(chǔ)量可以達(dá)到細(xì)胞干重的三分之一。脂肪酸合成主要的4步反應(yīng)包括縮合、還原、脫水和還原。ACP轉(zhuǎn)酰酶(FABD)、脂酰胺脫氫酶(DLD)、Δ12脂肪酸去飽和酶(FAD2)、烯酰-ACP還原酶(FABI)、Δ6脂肪酸去飽和酶(PTD12)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)等都與脂質(zhì)合成路徑有關(guān)。目前，磷限制是否對(duì)三角褐指藻油脂合成及油脂合成的分子機(jī)理等方面的研究還鮮有報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)研究了磷限制對(duì)三角褐指藻生長、脂質(zhì)含量的影響，并分析脂質(zhì)合成通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)量，為在基因?qū)用嫔细咝У靥岣呶⒃逵椭刻峁├碚撝巍?/p>

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用的藻種來源于寧波大學(xué)植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將藻液和f/2培養(yǎng)基按1∶3的比例接種培養(yǎng)。培養(yǎng)光照強(qiáng)度5 000 lx，光照與黑暗時(shí)間各為12 h，溫度20 ℃，pH為7.5，培養(yǎng)周期8 d。每天定時(shí)搖藻3次，防止藻細(xì)胞下沉。

1.2 磷濃度設(shè)置

本實(shí)驗(yàn)所用的是f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻。以硝酸鈉和磷酸二氫鈉作為氮源和磷源。保持氮濃度不變，設(shè)置磷濃度限制分別為0、16、32、48、64 μmol/L，以64 μmol/L為對(duì)照組，剩下4組為實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行。

1.3 三角褐指藻生長曲線的測定

磷限制處理實(shí)驗(yàn)開始后每隔24 h取三角褐指藻藻液3 mL用UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)測其在680 nm處的OD值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式y(tǒng)=977.73x-12.311(R2= 0.999)[14]換算成細(xì)胞數(shù)，其中y為細(xì)胞密度(104/mL)，x為吸光值。計(jì)算并繪制磷處理后的三角褐指藻生長曲線。

1.4 三角褐指藻總脂含量的測定

采用尼羅紅染色法[15]測定總脂含量。取2.5 mL藻液加入26 μL二甲基亞砜(DMSO)于試管中，微波處理40 s后再加入78 μL尼羅紅，混勻后50 ℃水浴染色5 min，用FLX800型熒光酶標(biāo)儀測其在激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長580 nm處的熒光值，再經(jīng)過計(jì)算得出總脂的相對(duì)含量。

1.5 三角褐指藻葉綠素a含量的測定

按照徐潤潔等[16]方法測量并計(jì)算葉綠素a含量：葉綠素a(μg/L)=13.95×A665-6.88×A649

1.6 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平

取50 mL的藻液放入冷凍離心機(jī)中，4 ℃，6 500 r/min離心10 min，結(jié)束后棄藻液，留下的藻泥按照試劑盒(Plant RNAKit，OMEGA)提取總RNA。用Takara PrimeScript RT Reagent kit(Prefectory Realtime)試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(RT-QPCR)檢測的模板。在NCBI上找到與三角褐指藻脂質(zhì)合成相關(guān)的基因，采用primer premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)上下游引物，引物設(shè)計(jì)好后由上海生工公司合成，用于RT-QPCR的基因信息見表1。用actin基因作為內(nèi)參基因[17]。RT-QPCR反應(yīng)體系為：SYBR Mix 10 μL，引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。總體系為20 μL。QPCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃，30 s。40個(gè)循壞反應(yīng)(延伸95 ℃，10 s。退火60 ℃，30 s。)，72 ℃，10 min。

表1 用于RT-QPCR的基因信息

1.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2-ΔΔCt方法對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用 SPSS 23.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析、相關(guān)性分析和主成分分析，P<0.05為顯著性(用*表示)，P<0.01為極顯著性(用**表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長的影響

研究磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長的影響，磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長和細(xì)胞密度的影響如圖1所示，結(jié)果表明(圖1a)，三角褐指藻細(xì)胞生長曲線呈S型生長，第1～5天是對(duì)數(shù)生長期，第5～7天是平臺(tái)期，第7天后藻細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。比較不同磷限制處理下在第7天時(shí)藻細(xì)胞的密度，結(jié)果表明(圖1b)，隨著磷限制程度的加強(qiáng)，藻細(xì)胞密度逐漸減少。當(dāng)磷濃度為0 μmol/L時(shí)，藻細(xì)胞衰亡最快，藻細(xì)胞密度比對(duì)照組下降了21%。說明磷限制明顯地抑制了三角褐指藻的生長。

圖1 磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長(a)和細(xì)胞密度(b)的影響

2.2 磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞總脂含量的影響

研究磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞總脂含量的影響，磷限制對(duì)三角褐指藻總脂和葉綠素a含量的影響如圖2所示，隨著磷限制程度的加強(qiáng)，總脂含量呈逐漸上升的趨勢。當(dāng)磷濃度為0 μmol/L時(shí)，其總脂含量均極顯著高于對(duì)照組。總脂含量分別比對(duì)照組提高了48.8%(第5天)和61.64%(第7天)，說明磷限制可顯著提高總脂含量。

圖2 磷限制對(duì)三角褐指藻總脂和葉綠素a含量的影響

2.3 磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞葉綠素a含量的影響

研究磷限制對(duì)三角褐指藻細(xì)胞葉綠素a含量的影響，結(jié)果表明(圖2b)，隨著磷限制程度的增加，葉綠素a含量整體呈下降趨勢。實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量跟對(duì)照組相比均極顯著降低。當(dāng)磷濃度為0 μmol/L時(shí)，葉綠素a含量比對(duì)照組下降了60.8%。表明磷限制抑制了葉綠素a的合成。利用Pearson相關(guān)分析磷限制下三角褐指藻總脂與葉綠素a含量的關(guān)系，結(jié)果表明，總脂含量和葉綠素a含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.949。

2.4 磷限制對(duì)三角褐指藻脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響及主成分分析

用RT-QPCR技術(shù)對(duì)脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，磷限制對(duì)三角褐指藻油脂合成基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)磷濃度為0 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ABD、DLD、FAD2、FABI、PTD12和ACC1等6個(gè)基因的表達(dá)量都極顯著上調(diào)，這與總脂含量變化一致。當(dāng)磷濃度為16 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ABD、DLD、FAD2、FABI、ACC1 等5個(gè)基因的表達(dá)量都極顯著上調(diào)。當(dāng)磷濃度為32 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ABD、DLD、ACC1等3個(gè)基因的表達(dá)量都極顯著上調(diào)。當(dāng)磷濃度為48 μmol/L時(shí)，ACC1基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)。說明脂質(zhì)合成基因?qū)Σ煌潭鹊牧紫拗朴衅眯浴?/p>

磷限制對(duì)三角褐指藻中脂質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)χ|(zhì)合成的累計(jì)貢獻(xiàn)率見表2。與脂質(zhì)合成有關(guān)的6個(gè)基因，其表達(dá)量對(duì)脂質(zhì)合成的貢獻(xiàn)率不一。前3個(gè)主成分因子對(duì)脂質(zhì)合成的達(dá)89.916%。由主成分載荷矩陣可知，載荷矩陣見表3，前3個(gè)主成分主要以DLD、FAD2和ACC1基因?yàn)橹鳎f明DLD、FAD2和ACC1 等3個(gè)基因是油脂合成的主要貢獻(xiàn)因子。

表2 磷限制對(duì)三角褐指藻中脂質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)χ|(zhì)合成的累計(jì)貢獻(xiàn)率

表3 載荷矩陣

3 討論

磷是僅次于氮元素的植物第二大限制元素，磷可調(diào)節(jié)微藻的細(xì)胞生長。不同種類藻對(duì)磷的敏感度不同。若夫小球藻(Chlorellazofingiensis)培養(yǎng)過程中磷質(zhì)量濃度為7.0～14.0 mg/L時(shí)藻細(xì)胞生長最好[18]。Wang等[19]研究表明，當(dāng)?shù)獫舛葹?4～72 mg/L、磷濃度為4.5～13.5 mg/L時(shí)，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的最終生物量和蛋白質(zhì)含量達(dá)最大值，葉綠體、線粒體等細(xì)胞器顯示出良好的結(jié)構(gòu)。但在高氮和低磷情況下，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞。李小梅等[20]研究表明，強(qiáng)烈的磷限制會(huì)抑制三角褐指藻細(xì)胞的生長速率，這與本研究結(jié)果相一致。可能因?yàn)榱自厝鄙伲?xì)胞會(huì)自發(fā)減少生長和代謝速率，從而充分利用細(xì)胞內(nèi)有效資源[21]。

有研究表明，低磷脅迫可促進(jìn)微藻脂質(zhì)積累。Liang等[22]研究表明，低磷使小球藻(Chlorellavulgaris)脂質(zhì)含量和脂質(zhì)生產(chǎn)率達(dá)到最大值。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，微藻在低磷脅迫下脂質(zhì)含量會(huì)減少，如微綠球藻(Nannochloropsisoculata)和綠色鞭毛藻(Greenflagellates)在磷限制下脂質(zhì)的含量降低[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷限制可促進(jìn)三角褐指藻脂質(zhì)的積累，這與Yang 等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。究其原因，這可能與植物的適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)。植物長時(shí)間在低磷或缺磷環(huán)境中生存，會(huì)進(jìn)化一套適應(yīng)機(jī)制，如能量代謝的變化、生物合成的變化、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的變化等[25]。三角褐指藻在低磷和缺磷環(huán)境下，后期細(xì)胞可能會(huì)利用碳水化合物和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)[24]。中性脂質(zhì)被確定為微藻中碳儲(chǔ)存的主要形式，所以細(xì)胞生長后期總脂含量增長較快。

磷對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)有重要的作用，一般與細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換、呼吸作用、光合作用和某些分子生物合成有關(guān)。磷是合成ATP和葉綠素的重要元素。磷的缺乏會(huì)使光合作用受到抑制，葉綠素a是光合作用的光合色素之一。添加磷元素可提高滸苔(Ulvaprolifera)藻體和考來木(Correacarmen)葉片葉綠素a含量[26，27]，而磷限制使葉綠素含量降低[20]。本研究也表明磷限制可顯著抑制葉綠素a的合成，且隨著磷限制程度的加強(qiáng)，葉綠素a含量逐漸降低，而總脂的含量卻逐漸增加，葉綠素a和脂質(zhì)合成存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

油脂的積累與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。劉鵬[28]研究表明ACCD基因的上調(diào)會(huì)促進(jìn)微藻脂質(zhì)合成。陳若瑩等[29]發(fā)現(xiàn)氮限制條件下，油脂積累量和FAB2基因成正相關(guān)關(guān)系。Lung等[30]指出DGAT基因是甘油三酯(TAG)合成的關(guān)鍵基因。王振瑤[31]發(fā)現(xiàn)在氮限制條件下，膠球藻(Coccomyxasubellipsoidea)中甘油三酯合成相關(guān)基因ACCA、ACCB、ACCC和FABD的表達(dá)量上調(diào)。本研究結(jié)果也表明，磷限制下三角褐指藻ACC1、FABD基因表達(dá)上調(diào)。DLD基因編碼的脂酰胺脫氫酶催化用于從頭合成脂肪酸的乙酰輔酶a和NAPH的產(chǎn)生，為油脂合成提供原料和能量。本研究結(jié)果表明，在磷限制條件下，DLD基因是油脂合成的主要貢獻(xiàn)因子，說明油脂合成和碳代謝聯(lián)系緊密。這和之前推測磷限制條件下，油脂含量的增加與碳水化合物代謝和蛋白質(zhì)分解有關(guān)的結(jié)論一致。FAD2 基因參與不飽和脂肪酸的合成，F(xiàn)AD2基因誘變可增加食用花生油油酸含量[32]，說明FAD2基因是油脂合成的關(guān)鍵基因之一。與本研究主成分分析結(jié)果一致。在磷限制條件下，DLD、FAD2和ACC1是油脂合成的主要貢獻(xiàn)因子，其中DLD基因?qū)τ椭铣傻呢暙I(xiàn)率最大，這為進(jìn)一步通過細(xì)胞培養(yǎng)和基因工程策略提高三角褐指藻油脂含量和探究油脂合成分子機(jī)理提供了目標(biāo)基因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，磷限制雖然極顯著地抑制了三角褐指藻細(xì)胞生長和葉綠素a含量，但卻極顯著地促進(jìn)了油脂的積累，油脂含量與葉綠素含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。油脂含量與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平有關(guān)，主成分分析表明，DLD、FAD2和ACC1是油脂合成的主要貢獻(xiàn)因子，其中DLD基因?qū)τ椭铣傻呢暙I(xiàn)率最大。