不同濃度茶多酚對脂多糖誘導的內皮細胞中NF-κB p65表達的影響

李百齊，許偉，李萍，高麗，宋琦，張庭婷

1.遵義醫科大學口腔醫學，貴州 遵義 563099；2.遵義醫科大學附屬口腔醫院病理科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫科大學附屬口腔醫院牙周科，貴州 遵義 563099

在牙周病與心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)相關性研究中，關于牙周病原菌的研究較為常見，尤其是牙周病原菌與內皮細胞之間的關系，一直是研究的重要內容之一。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是一種重要的慢性牙周炎致病菌，內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)被認為是其中最重要的一種毒力因素[1]，通?？梢蚤g接促進CVD的發生和發展。

作為核轉錄因子家族的一員，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)一般存在于細胞漿內，其具有各類基因轉錄調控功能。這種因子通過某些信號通路參與人體內細胞的感染、免疫、炎癥反應等的發生[2]，當它從胞漿轉位進入胞核內時，能夠通過合成炎癥反應因子，進而導致機體產生炎癥反應[3]。茶多酚(tea polyphenols，TP)是茶葉中多羥基酚類化合物的復合物，具有抗炎、抗氧化等生物活性，為茶葉保健功能的主要化學成分[4]。但TP抗炎作用機制是否與NF-κB有關目前鮮少報道。本實驗主要觀測不同濃度TP 對Pg-LPS誘導的HUVECs中NF-κB p65表達影響，進而探討TP對血管內皮細胞的調節及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Pg-LPS(InvivoGen 公司)、TP(陸圣康源科技公司)、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)、細胞裂解液、核蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶公司)、NF-κB p65多克隆抗體(Abcam公司)等。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs 的培養及鑒定 獲得遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準同意后，筆者按照醫院倫理委員會標準操作規程完成取材與細胞培養。選取足月妊娠的健康新生兒臍帶(由婦產科提供，告知患者及家屬具體實驗途徑且得到準許)，在4 h 內開始細胞培養。常規換液，以1∶2 的比例做傳代培養，篩選3～4代對數生長期細胞作實驗樣本。實驗前利用倒置顯微鏡觀察細胞的形態與結構，選擇DAB免疫組織化學顯色法來作為細胞鑒定法完成細胞鑒定。

1.2.2 CCK-8細胞活性檢測法 采用0.25%胰酶消化制備HUVECs細胞懸液，細胞密度為2×105個/孔，100 μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養箱中培養24 h后分別設TP 組(5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L)和Pg-LPS組(0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，于5%CO2、37℃、100%濕度培養箱中分別培養至規定時間：TP 組12 h、24 h、48 h，Pg-LPS 組4 h、8 h、24 h。結束后分別加入CCK-8 液20 μL，繼續培養1～4 h 后取出，篩選出合適的藥物濃度及時間。實驗分組為Control 組、Pg-LPS組、LPS+TP1組(5 mg/L)、LPS+TP2組(40 mg/L)。選取對數生長期HUVECs，通過0.25%胰蛋白酶完成細胞懸液的消化(細胞數為2×105/mL)，將其接種在6 孔培養板內，各孔加2 mL。保持原有環境進行培養，待細胞單層完全鋪滿6孔板底，在LPS+TP1組內添加5 mg/L、LPS+TP2組添加40 mg/L TP培養液，其余各組進行原培養液的更換。保持原環境繼續培養12 h，進行洗板后將Control組的原培養液加以更換，其余各組均添加10 μg/mL的Pg-LPS培養液并培育24 h，從而完成炎癥反應實驗模型的建立工作。

1.2.3 Western blot 法檢測細胞內NF-κB p65 蛋白含量 取HUVECs 離心后的上清液置于6 孔板內，加入RIPA 裂解液提取出細胞總蛋白；同樣，加入漿蛋白抽提試劑提取出漿蛋白、加入核蛋白抽提試劑提取出核蛋白，定量采用BCA法。SDS-PAGE將各蛋白電泳分離，進行電轉膜。用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)在室溫封閉1 h，加入不同濃度稀釋濃度的一抗：NF-κB p65(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)和Histone H1(1∶1 000)，4℃輕搖過夜后先用TBST洗膜兩次，后滴加羊抗兔IgG二抗，比例為1∶20 000，室溫孵育1 h后漂洗3次，ECL顯影，蛋白相對表達量以β-actin和Histone H1為內參。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0 軟件處理數據，計量資料符合正態分布，以均數±標準差()表示，多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA test)，組間多重比較采用最小顯著性差異法(LSD法)檢驗；多重比較用Dunnett-T檢驗。檢驗水準α=0.05，P＜0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞來源鑒定 原代內皮細胞貼壁生長，多呈梭形或多角形，胞核呈類圓形或圓形，可見1～2個核仁。細胞外觀呈現鋪路石狀排列(圖1)。經第Ⅷ因子相關抗原熒光鑒定呈陽性，為內皮細胞(圖2)。

圖1 原代人臍靜脈內皮細胞光鏡下形態(×200)

圖2 第Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色(×200)

2.2 CCK-8 法對TP 和Pg-LPS 進行藥物濃度的篩選

2.2.1 TP 對HUVECs 生長活力的影響 檢測后可發現HUVECs 的活性與TP 濃度、培養時間相關。同一濃度TP作用后，與24 h和48 h相比，作用12 h后的細胞增殖率較高，差異有統計學意義(P＜0.05)；在濃度為5～40 mg/L 時，不同作用時間均促進HUVECs 增殖，但達到80 mg/L 后便對細胞增殖率出現抑制作用。因此選取培養時間為12 h，濃度分別為5 mg/L、40 mg/L 進行后續實驗，見表1。

表1 不同濃度TP作用HUVECs的增殖率(n=6，，%)

表1 不同濃度TP作用HUVECs的增殖率(n=6，，%)

2.2.2 Pg-LPS 對HUVECs 生長活力的影響 與Control組相比，在不同時間和不同濃度條件下(4 h、8 h、24 h；0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，Pg-LPS 均對細胞增殖產生抑制作用，其抑制率與作用時間和濃度相關(P＜0.05)，見表2。綜合實驗結果，將選取濃度為10 μg/mL Pg-LPS、作用時間為24 h 的條件進行后續實驗。

注：相同時間作用下，與Control組比較，aP＞0.05；bP＜0.05；相同濃度下，與4 h比較，cP＜0.05；與8 h比較，dP＜0.05。

2.3 Western blot 法檢測細胞內NF-κB p65 蛋白含量 NF-κB p65的蛋白含量及蛋白相對表達見圖3和表3。與Control組比較，經Pg-LPS處理后的細胞核內p65表達增加，胞漿內p65表達降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與Pg-LPS 組相比較，經TP 處理后的細胞核內p65表達降低，胞漿內p65表達增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

注：與Control 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與LPS+TP1組比較，cP＜0.05。

圖3 Western Blot法測定細胞NF-κB p65蛋白相對表達

3 討論

相關研究認為牙周疾病與全身系統性疾病如糖尿病、CVD 等均有著密切的關系[5]。牙周感染與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的相關性已有許多學者研究以及輔以流行病學進行佐證，而細胞因子之間的相互作用正是牙周病與AS之間產生關聯的生物學基礎[6-7]，特別是牙周致病菌感染如牙齦卟啉單胞菌、放線桿菌集合菌、中間小球藻、連翹坦索菌和核梭菌等均對AS的形成與進展有一定的貢獻[8-9]。

內皮細胞功能紊亂是AS 產生的最早、最主要的血管表現之一。血管內皮細胞和內皮細胞釋放的活性因子是調控血管舒張功能的重要因素。當血管內皮細胞微循環發生障礙時，炎性因子產物增多，進而發生炎癥反應，血管內皮細胞修復能力會受損。吳贇等[10]研究發現，當Pg-LPS 終濃度分別為0.1 mg/L 和1.0 mg/L時，臍靜脈內皮細胞均會產生早期焦亡表現，當濃度升至10 mg/L、培養時間為72 h 時會出現細胞死亡等現象，這反映Pg-LPS通過影響內皮細胞的功能來產生作用，對AS的發生機制有一定的意義，進而在牙周病與AS的相互關聯中發揮了作用。研究表明，茶葉中的提取物TP對抑制炎癥反應、抗氧化、抑制血管內皮細胞障礙等方面有重大作用[11-14]。王忠麗[15]在其研究中提到，為了檢測高糖環境下TP對內皮細胞的作用，應用TP(濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L)對內皮細胞分別進行干預，觀察細胞內內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metallop roteinase inducer，EMMPRIN)的表達變化，最終得出結論，高糖環境下可通過p38MAPK 信號通路抑制HUVECs 的活性，而20 mg/L TP 可以抑制此作用以促進EMMPRIN 的表達，抑制HUVECs 表達ET-1，進一步保護了內皮細胞；但在30 mg/L 濃度下，TP 雖然可以降低高糖環境對細胞的影響，但對正常細胞活性有所影響。在本實驗中CCK-8 檢測結果顯示：①與Control 組相比較，不同濃度的TP 與HUVECs 一起培養12 h，當TP 濃度為80 mg/L 時促進細胞增殖的作用減弱，達到160 mg/L時可呈負值，表現出對細胞增殖的抑制作用；在同一濃度條件下，將TP 作用時間延長至24 h 和48 h，其產生抑制作用需要達到的濃度與時間呈負相關。實驗結果顯示，TP既能夠促進HUVECs增殖，也能抑制細胞增殖，其促進或抑制作用取決于TP作用的時間長短或濃度高低：若TP濃度低于80 mg/L，則會對HUVECs增殖產生促進作用，若TP 濃度高于80 mg/L 則對HUVECs的增殖產生抑制作用(P＜0.05)，差異有統計學意義?？偟膩碚f，隨著TP作用時間增加，促進細胞增殖的作用減弱，抑制細胞增殖的作用增強。②與Control組相比較，不同濃度的Pg-LPS 對于HUVECs 的抑制作用不同。在不同時間、不同濃度條件下(4 h、8 h、24 h；0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，Pg-LPS均可抑制HUVECs的增殖作用，且其抑制率隨時間和濃度的增加而提高(P＜0.05)，差異有統計學意義。本實驗推測TP對HUVECs的增殖與抑制作用可能與濃度及時間有密切的關系，研究結果也與相關研究結果基本一致。但對于TP出現的低濃度促進、高濃度抑制與短時促進、長時抑制細胞增殖的現象，還需更深入地研究其作用機制。

NF-κB是人體內炎癥因子被激活、產生炎癥反應重要的一環。WANG等[16]研究發現，TP中的主要兒茶素(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)通過抑制NF-κB活化來抑制HUVECs 中TNF-α誘導的炎癥因子表達。李昆蔓等[17]認為，NF-κB/iNOS/NO是一種在血管內皮細胞發生增殖凋亡失衡時發揮重要作用的信號通路，處于非生理狀態時，NF-κB被激活會導致其表達增強，并進入細胞核內參與炎癥反應。此實驗也通過Pg-LPS來完成對內皮細胞的誘導，他們認為血管內皮細胞的破壞可能是受到該激活后的信號通路的影響，并導致AS癥狀的發生和發展。ZHANG等[18]發現，LPS通過誘導NF-κB信號通路的激活，使得磷酸化p65蛋白表達增強。本研究結果顯示：①與Control 組相比，經Pg-LPS 誘導后的HUVECs 細胞核內NF-κB p65 蛋白表達升高，而胞漿內NF-κB p65 表達下降(P＜0.05)，差異有統計學意義；②與Pg-LPS 組相比，用一定濃度TP預處理HUVECs后，細胞核內NF-κB p65 蛋白表達降低，且胞漿內NF-κB p65 蛋白表達增加(P＜0.05)，差異有統計學意義，推測TP 可以抑制Pg-LPS 的誘導作用?？偨Y以上結果，本實驗認為TP 可以抑制NF-κB p65由胞漿轉位至細胞核，即可能抑制NF-κB的活化。結果與以往研究基本一致，推測TP抑制Pg-LPS誘導的HUVECs內炎癥反應可能與抑制NF-κB的活化有關。

綜上所述，TP對內皮細胞的作用與濃度及時間密切相關，其作用在有效范圍內具有濃度依賴性：具有低濃度促進、高濃度抑制與短時促進、長時抑制細胞增殖的特點。其次，TP 通過抑制NF-κB 的活化來抑制Pg-LPS誘導的內皮細胞炎癥反應，可以對內皮細胞起到一定保護作用。雖然有部分研究證明TP在糖尿病、AS等疾病中有潛在功能進行預防和治療，但尚未有實驗證明其對人類健康的影響[19-21]，本實驗雖然并未在體內模擬條件下對TP進行分析，對于TP能否產生相同作用也需進一步研究，但本實驗可以得出：TP在細胞實驗中可以通過抑制NF-κB的活化來抑制Pg-LPS誘導的HUVECs內炎癥反應，進而起到保護內皮細胞的作用。