FGF2、CYSLTR1、RSAD2和HLA-DRA的表達水平與彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的相關性

劉利，李珊珊，余楚壬，袁玉，代懷杰，曹培杰

東莞市厚街醫(yī)院腫瘤血液科，廣東 東莞 523945

彌漫性大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是侵襲性非霍奇金淋巴瘤的最常見類型，可以是原發(fā)或由惰性淋巴瘤的轉化引起[1-2]。使用標準的化學免疫療法可以使很多患者在臨床上得到緩解甚至治愈。然而，由于耐藥或復發(fā)，約有1/3的患者預后較差，這與DLBCL 的異質性有關[3-5]。這種異質性不僅表現(xiàn)在臨床上，而且還表現(xiàn)在形態(tài)，遺傳學和免疫表型上。但是，當前的預后評分系統(tǒng)根據(jù)臨床水平的國際預后指數(shù)(international prognostic index，IPI)對DLBCL患者進行分層，包括年齡、分期、行為狀態(tài)(PS)、血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平和結外受累程度[6-7]。實際上，近年來已經發(fā)現(xiàn)了許多免疫相關的基因在DLBCL 患者中異常表達，并且其異常表達在DLBCL 的進展、維持和對治療的反應中起著重要的作用[8-10]。然而，目前尚無應用免疫相關基因聯(lián)合對DLBCL患者的預后進行個體化地預測及對其進行危險分層[6-7]。因此，迫切需要構建基于免疫基因表達水平的DLBCL 患者的預后分層，以指導臨床治療。

本研究中，基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)和癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)測序數(shù)據(jù)被用以全面評估免疫相關基因的表達水平對DLBCL患者總體生存(overall survival，OS)的影響及構建危險分層。這些探索對于評估DLBCL患者的預后以及發(fā)現(xiàn)靶向免疫方法具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取及DLBCL患者的基本信息 來自GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE87371數(shù)據(jù)集被下載[11-12]，除去無完整的生存時間及生存狀態(tài)的標本外，總共有221 例DLBCL 患者的RNA 測序的數(shù)據(jù)被用于本研究的預后分析。同時，其他的臨床信息也被下載，包括性別、年齡、Ann Arbor 分期(stage)和IPI。此外，從UCSC-xena(https://xenabrowser.net/datapages/)[13]上下載了TCGA 數(shù)據(jù)庫(http://www.tcga.org/)中48例DLBCL患者的RNA測序數(shù)據(jù)，其基因表達水平以log2(norm_count+1)的形式表示。同時，獲取相應的臨床信息列于表1，包括總體生存時間、生存狀態(tài)、性別、年齡、LDH水平、結外浸潤的數(shù)目、Ann Arbor 分期和IPI。OS是指從確診DLBCL開始到患者任意原因死亡或最后一次隨訪日期所持續(xù)的時間。GSE87371 和TCGA 數(shù)據(jù)集分別被分配為訓練(training cohort)和驗證(validation cohort)組。

表1 GSE87371和TCGA 數(shù)據(jù)集中的DLBCL 患者的臨床信息[例(%)]

1.2 獲取免疫相關基因 免疫學數(shù)據(jù)庫和分析門戶(ImmPort，immunology database and analysis portal) 數(shù)據(jù)庫(https://www.immport.org/)提供并更新了2 498 個免疫相關的基因用于科學研究，并且這些基因已經被確定參與了關于免疫的生物學過程。因此，ImmPort 數(shù)據(jù)庫中這部分的基因用于DLBCL 患者的預后分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有的統(tǒng)計分析均在R 語言(version 4.0.2，https://www.r-project.org/)中進行。“survival”包用于單因素和多因素COX比例風險回歸模型的構建，而且只有當單因素COX 回歸分析中P＜0.05的變量才被納入多因素COX回歸分析。“survminer”包中的“surv_cutpoint”函數(shù)用于確定基因表達或者風險分數(shù)的最佳預后截斷值。“survivalROC”包用于繪制時間依賴性接收器工作特性曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線并獲取曲線下面積(area under curve，AUC)。Log-rank 檢驗用于Kaplan-Meier 曲線間的差異比較。用χ2檢驗來比較定性變量間的差異。雙尾的P＜0.05被認為是差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 確定與預后相關的免疫基因 在GSE87371和TCGA 數(shù)據(jù)集中，分別有1 242個和1 345個免疫相關的基因被用于預后分析(圖1)。接下來單因素COX回歸模型被進一步用于分析，按照P＜0.05 的標準，在GSE87371數(shù)據(jù)集中總共有200個與預后相關的基因，而TCGA 數(shù)據(jù)集中則有51 個與預后相關的基因。為了確定基因在兩個數(shù)據(jù)集中均與預后有關而且預后模式一致，單因素COX 模型中的系數(shù)大于0 和小于0的基因分別被用于繪制韋恩圖。結果顯示，有4 個免疫相關基因包括成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)，半胱氨酰白三烯受體1 (cysteinyl leukotriene receptor 1，CYSLTR1)，包含2個的S-腺苷甲硫氨酸基團(radical S-adenosyl methionine domain containing 2，RSAD2)和Ⅱ類主要組織相容性復合體DRα(major histocompatibility complex、class Ⅱ、DR alpha、HLA-DRA)的單因素COX 系數(shù)同時在GSE87371和TCGA數(shù)據(jù)集中大于0，而并沒有出現(xiàn)免疫相關基因的單因素COX 系數(shù)同時在兩個數(shù)據(jù)集中均小于0 的情 況(圖2A)。因 此，F(xiàn)GF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA將被用來進行接下來的預后及聯(lián)合分析。

圖1 免疫相關基因的表達譜

森林圖被進一步用于可視化FGF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA 的表達水平對DLBCL 患者OS的影響，結果顯示，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中，其高表達與DLBCL患者的不良OS顯著相關，而且這個結果在TCGA數(shù)據(jù)集中得到驗證[風險比(hazard ratio，HR)＞1，P＜0.05](圖2B)。為了將這4 個與預后相關的免疫基因進行聯(lián)合，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中進行了多因素COX 回歸模型分析，根據(jù)其系數(shù)β來計算風險分數(shù)(risk score)，結果顯示：Risk score=0.27x (FGF2 的表達水平)+0.07x(CYSLTR1的表達水平)+0.04 x(RSAD2的表達水平)+0.23x(HLA-DRA的表達水平)。同時，雷達圖顯示，相比于CYSLTR1，RSAD2和HLA-DRA，F(xiàn)GF2的表達水平對DLBCL的OS的貢獻度最大(圖2C)。

圖2 免疫相關基因的預后分析

2.2 FGF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA 的Kaplan-Meier 曲線分析 為了進一步確定高和低表達FGF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA 是否對DLBCL患者的OS有影響，Kaplan-Meier曲線被用來對其進行評估。首先，R語言包“survminer”被用于定義基因表達的最佳預后截斷值(圖3)。然后，根據(jù)最佳預后截斷值，將基因的表達水平分為高和低表達兩組來繪制Kaplan-Meier 曲線。結果顯示，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中，高表達FGF2 的DLBCL 患者具有較差的OS[HR=1.63(95%置信區(qū)間CI：1.19～2.23)，P=0.002]。這個結果在TCGA數(shù)據(jù)集中得到驗證[HR=4.74(95%CI：1.06～21.25)，P=0.025]。同樣地，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中CYSLTR1 的高表達與患者較差的OS 密切相關[HR=1.72(95%CI：1.20～2.46)，P=0.003]。這個結果在TCGA 數(shù)據(jù)集中得到驗證[HR=7.24 (95%CI：1.61～32.62)，P=0.003]。另外，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中，RSAD2 的高表達同樣與患者的不良OS 顯著相關[HR=1.45(95%CI：1.05～1.99)，P=0.023]。這個結果在同樣也在TCGA數(shù)據(jù)集中得到驗證[HR=4.22(95%CI：0.99～17.88)，P=0.034]。相似地，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中，高表達HLA-DRA能夠預測DLBCL患者較差的OS[HR=1.49(95% CI：1.08～2.04)，P=0.014]。這個結果在在TCGA 數(shù)據(jù)集中再次得到驗證[HR=15.93 (95%CI：3.11～81.48)，P＜0.001](圖4)。這個結果提示，F(xiàn)GF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA 的高表達與DLBCL患者的不良OS顯著相關，其值得進一步探討。

圖4 免疫相關基因的生存曲線分析

2.3 危險分層 為了探討由FGF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA 的聯(lián)合能否對DLBCL 患者進行危險分層，由這四個基因計算的風險分數(shù)的預后價值應首先被探討。如見表2 和表3 所示，單因素和多因素COX 回歸模型分析表明，在GSE87371 數(shù)據(jù)集中，風險分數(shù)是DLBCL 患者的獨立預后影響因子[HR=1.79(95%CI：1.27～2.52)，P＜0.001]。這個發(fā)現(xiàn)同樣在TCGA 數(shù)據(jù)集中得到進一步地確認[HR=8.80(95%CI：1.97～39.42)，P=0.004]。接下來，在GSE87371數(shù)據(jù)集中，R 語言包“survminer”被用于確定風險分數(shù)的最佳預后截斷值4.12，根據(jù)最佳截斷值，DLBCL 患者被劃分為兩組：高風險(high risk)和低風險(low risk)組。繪制的Kaplan-Meier曲線提示，高風險組DLBCL患者的OS 顯著低于低風險組[HR=2.04 (95%CI：1.46～2.86)，P＜0.001]。進一步繪制時間依賴性ROC曲線的AUC為0.82，其明顯大于0.5(圖5A)。相似地，這個發(fā)現(xiàn)在TCGA 數(shù)據(jù)集中也得到驗證，即高風險與DLBCL 患者的不良OS 明顯相關[HR=8.80 (95%CI：1.97～39.42)，P＜0.001]。時間依賴性ROC曲線的AUC為0.89，其同樣明顯大于0.5(圖5B)。這個結果提示，由FGF2、CYSLTR1、RSAD2和HLA-DRA的聯(lián)合能夠很好地將DLBCL患者進行危險分層。

圖5 根據(jù)風險分數(shù)對DLBCL患者進行危險分層

表2 單因素COX回歸分析

表3 多因素COX回歸分析

3 討論

危險分層的建立可為臨床醫(yī)生更合理地管理癌癥患者和個性化治療方案的選擇提供參考[14]。近年來，免疫相關基因可以提供個性化的免疫特征來評估癌癥患者的預后及進行危險分層[15-17]。在這項研究中，從GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫中的兩個大型DLBCL 隊列中獲取了不同的免疫相關基因用于分析和驗證。結果發(fā)現(xiàn)，免疫相關基因FGF2、CYSLTR1、RSAD2 和HLA-DRA的聯(lián)合可以預測DLBCL患者的預后，同時對其進行基于基因水平的危險分層。值得注意的是，這4個免疫基因的聯(lián)合是DLBCL患者的獨立預后影響因子，而且時間依賴性的ROC曲線也確認了由他們構建的危險分層具有良好的預測預后的性能。

研究表明，F(xiàn)GF2 在人白血病和淋巴瘤中的表達顯著增高[18]，同時其高表達與癌癥患者不良的預后密切相關[19-20]。這個發(fā)現(xiàn)與本研究的結果一致，即高表達FGF2 的DLBCL 患者的OS 較差。另外，CYSLTR1 的高表達能夠預測黑色素瘤、大腸腺癌和乳腺癌患者的不良預后[21-23]。然而，在DLBCL 患者中尚無相關的研究報道。本研究表明，高表達CYSLTR1 與DLBCL 患者的較差OS顯著相關，與已有的報道一致。同樣地，雖然有研究報道RSAD2能夠預測多種癌癥患者的不良結局[24-25]，但是在DLBCL中鮮有研究。在這項研究中，相對于低表達RSAD2組，高表達RSAD2的DLBCL患者的OS 較差。有趣的是，另外一個免疫相關的基因HLA-DRA在癌癥中也進行大量的研究，其在癌癥中高表達，而且其高表達與患者的不良預后密切相關[26-27]，而在DLBCL中也同樣無相關的研究。本研究的結果顯示，高表達HLA-DRA的DLBCL患者OS較差。這些發(fā)現(xiàn)提示，F(xiàn)GF2、CYSLTR1、RSAD2和HLA-DRA具有作為構建DLBCL患者危險分層的巨大潛力。

該研究的局限性在于沒有DLBCL臨床樣本和相應的臨床信息用于驗證由FGF2、CYSLTR1、RSAD2和HLA-DRA構建的危險分層。此外，本研究還缺乏體外和體內實驗的驗證，因此，結果的可靠性仍然受到挑戰(zhàn)。

總的來說，高表達免疫相關基因FGF2、CYSLTR1、RSAD2和HLA-DRA的DLBCL的OS較差，并且聯(lián)合這4個基因可以對DLBCL患者進行危險分層。同時，這些發(fā)現(xiàn)為DLBCL患者的個性化預后預測提供了參考，并且可能是設計新療法的潛在免疫標記物。