高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羚羊感冒片中7種活性成分的含量

張煒文，戴文科

（1. 江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226000；2. 宏冠生物藥業(yè)有限公司，浙江 嘉興 314500）

羚羊感冒片由羚羊角、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、金銀花、連翹、荊芥、淡竹葉、薄荷素油和甘草等10味藥材制成，具有清熱解表之功效，臨床用于伴有發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛頭暈、咳嗽、胸悶及咽喉腫痛等癥候的流行性感冒疾病治療[1]。方中連翹活性成分連翹酯苷A和連翹苷可能為連翹抑菌活性的有效成分[2]；甘草活性成分甘草酸具有抗過(guò)敏和抗炎作用，甘草苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、解痙等功效[3-4]；金銀花具有清熱解毒、宣散風(fēng)熱的功效，黃酮類(lèi)化合物木犀草苷是其主要活性成分[5-6]。該藥收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)牛蒡子的活性成分牛蒡苷做了定量檢查要求，文獻(xiàn)報(bào)道中[7-9]，研究標(biāo)的至多針對(duì)羚羊感冒片中3味藥材，作為其質(zhì)控和評(píng)價(jià)方法顯然不夠全面。

中藥制劑往往由幾種或數(shù)十種藥材制成，化學(xué)成分極其豐富，因此，中藥制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)具有系統(tǒng)性和全面化。本研究采用高效液相色譜（HPLC）波長(zhǎng)切換法，同時(shí)測(cè)定羚羊感冒片中牛蒡苷、甘草苷、綠原酸、木犀草苷、連翹苷、連翹酯苷A和甘草酸銨7種組分的含量，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和實(shí)用，可為羚羊感冒片質(zhì)量考察提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695/2996型高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，UV 2489檢測(cè)器，Empower 2.0工作站（美國(guó)Waters公司）；AUW220D型電子天平（d=0.01 mg，日本島津公司）；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

羚羊感冒片（每片重0.3 2 g，批號(hào)分別為20180501，20180502，20180601，20180602，20180604，20180901，吉林濟(jì)邦藥業(yè)有限公司）；牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)：110819-201812，純度：95.0 %），木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-201609，純度：94.9 %），連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201816，純度：95.1 %），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8 %），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201607，純度：93.1 %），連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)：111810-201707，純度：97.2 %），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201720，純度：97.7 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取牛蒡苷、甘草苷、連翹酯苷A、綠原酸、木犀草苷、連翹苷和甘草酸銨對(duì)照品各適量，加50 %甲醇制成每1 ml含牛蒡苷 0.175 mg、甘草苷0.068 mg、連翹苷 0.102 mg、綠原酸 0.110 mg、木犀草苷0.037 mg、連翹酯苷A 0.045 mg、甘草酸銨 0.048 mg的混合對(duì)照品溶液，混勻，濾過(guò)（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，過(guò)篩（80目），取細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇30 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 單味藥材對(duì)照品溶液 按工藝方法分別取甘草、金銀花、牛蒡子和連翹細(xì)粉（過(guò)80目篩）適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備，搖勻，濾過(guò)（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得單味藥材對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件[10-11]

色譜柱：Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，12 %A；10～15 min，12 %A→18 %A；15～30 min，18 %A→25 %A；30～32 min，25 %A→36 %A；32～38 min，36 %A；38～46 min，36 %A→60 %A；46～60 min，60 %A→70 %A），后運(yùn)行時(shí)間20 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～16 min，328 nm（檢測(cè)綠原酸、連翹酯苷A）；16～30 min，280 nm（檢測(cè)連翹苷、牛蒡苷）；30～38 min，237 nm（檢測(cè)甘草苷）；38～56 min，350 nm（檢測(cè)木犀草苷）；56 min，245 nm（檢測(cè)甘草酸銨）；進(jìn)樣量為10 μl；流速為1.0 ml/min；柱溫為35 ℃。取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及單味藥材對(duì)照品溶液各10 μl，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。理論板數(shù)按牛蒡苷、甘草苷、木犀草苷及甘草酸銨計(jì)均大于3500，供試品色譜圖中各峰分離完全（分離度大于1.5），各目標(biāo)色譜峰對(duì)稱性良好（對(duì)稱因子在0.94～1.16之間）。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.3 線性關(guān)系考察

取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取2，4，8，16，20，25，30，40 μl，注入液相色譜儀，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，各組分峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組分回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明7組分在各自線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，該方法適用于定量檢測(cè)要求。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄各組分色譜圖峰面積。結(jié)果牛蒡苷、甘草苷、綠原酸、木犀草苷、連翹苷、連翹酯苷A和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.1 %，0.4 %，0.2 %，1.3 %，0.8 %，1.2 %，0.6 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)：20180501）溶液適量，分別放置0，3，6，10，15，20，24 h后，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果牛蒡苷、甘草苷、綠原酸、木犀草苷、連翹苷、連翹酯苷A和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.8 %，0.9 %，0.6 %，1.6 %，1.2 %，1.4 %，1.0 %（n=7），表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批羚羊感冒片供試品（批號(hào)：20180501），除去包衣，研細(xì)，取細(xì)粉適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，取續(xù)濾液適量，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各組分含量RSD值。結(jié)果6份樣品中牛蒡苷、甘草苷、連翹苷、綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A和甘草酸銨的含量平均值分別為10.772，3.103，2.268，6.148，1.820，2.084，2.264 mg/g，含量RSD分別為0.5 %，0.8 %，1.0 %，0.6 %，1.0 %，0.9 %，0.6 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量羚羊感冒片（批號(hào)：20180501）20片，除去包衣，研細(xì)，取細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，同時(shí)稱取6份，分別置具塞錐形瓶中，每瓶精密加入每1 ml含牛蒡苷 2.599 mg、甘草苷0.818 mg、連翹苷 1.368 mg、綠原酸 1.546 mg、木犀草苷0.453 mg、連翹酯苷A 0.502 mg和甘草酸銨 0.639 mg的混合對(duì)照品溶液1 ml，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各組分的加樣回收率及RSD值，見(jiàn)表2。

表2 7個(gè)組分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 樣品測(cè)定

取6批羚羊感冒片，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各組分峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中牛蒡苷、甘草苷、綠原酸、木犀草苷、連翹苷、連翹酯苷A和甘草酸銨的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 羚羊感冒片中7種成分的含量（n=3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究首先考察了甲醇-水及乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，有個(gè)別目標(biāo)化合物（甘草苷、木犀草苷和連翹酯苷A）無(wú)法檢測(cè)，乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)色譜峰峰形較差，因此在水相中加入適量磷酸作為改性劑。結(jié)果當(dāng)采用乙腈-0.05 %磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)化合物分離度較好，且峰形對(duì)稱，因7種目標(biāo)化合物極性差異較大，使用梯度洗脫可大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)7個(gè)組分采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)段進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸特征吸收波長(zhǎng)分別為217，240，328 nm，連翹苷和牛蒡苷在（280±2） nm處有最大吸收，木犀草苷特征吸收波長(zhǎng)為253，350 nm，甘草苷特征吸收波長(zhǎng)為237 nm，連翹酯苷A和甘草酸銨的特征吸收波長(zhǎng)分別為328，245 nm，因各波長(zhǎng)差異較大，本研究利用儀器波長(zhǎng)自動(dòng)切換功能，分段切換波長(zhǎng)，使各目標(biāo)化合物均在最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度。檢驗(yàn)波長(zhǎng)設(shè)置為：0～16 min，328 nm（檢測(cè)綠原酸、連翹酯苷A），16～30 min，280 nm（檢測(cè)連翹苷、牛蒡苷），30～38 min，237 nm（檢測(cè)甘草苷），38～56 min，350 nm（檢測(cè)木犀草苷），56 min，245 nm（檢測(cè)甘草酸銨）。

本研究采用HPLC法，同時(shí)測(cè)定羚羊感冒片中7種活性成分（牛蒡苷、甘草苷、綠原酸、木犀草苷、連翹苷、連翹酯苷A和甘草酸銨）含量，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用，能全面、準(zhǔn)確地考察和評(píng)價(jià)羚羊感冒片的質(zhì)量，為該藥質(zhì)量控制和藥品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。