低C/N亞鐵氧化硝酸鹽還原菌群脫氮特性

周佳敏 ,黃廷林 *,劉 茜 ,楊尚業(yè) ,寇莉青 (1.西安建筑科技大學(xué),陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安710000；2.西安建筑科技大學(xué),西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710000；.陜西省引漢濟(jì)渭工程建設(shè)有限公司,陜西 西安 710010)

目前,幾乎每座水庫(kù)都存在一定程度富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題,嚴(yán)重的已經(jīng)不能作為供水水源[1-2].而氮源污染是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因之一.控制氮源污染成為解決微污染水體問(wèn)題的重要環(huán)節(jié)[3].

生物脫氮法由于具有高效、低耗的特點(diǎn),成為飲用水源脫氮處理中經(jīng)濟(jì)有效的方法之一[4].對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏的微污染水源水體,碳源不足已成為傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)的重大瓶頸[5].研究[6-8]發(fā)現(xiàn),以鐵、錳等無(wú)機(jī)物質(zhì)作為電子供體來(lái)輔助低有機(jī)碳水體進(jìn)行生物脫氮是一種高效、便捷、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的生物工藝.研究者發(fā)現(xiàn),部分 Fe(Ⅱ)氧化與 Fe(Ⅲ)還原是由特定微生物驅(qū)動(dòng)的酶促反應(yīng)[9].這些微生物能夠利用Fe(Ⅲ ) / Fe(Ⅱ )耦合其他的電子供體或者電子受體進(jìn)行鐵的氧化還原,從而形成了一個(gè)持續(xù)的生物調(diào)控的鐵的地球化學(xué)循環(huán).部分異養(yǎng)反硝化菌可以利用亞鐵為電子供體進(jìn)行硝酸還原,被稱(chēng)為亞鐵氧化硝酸鹽還原菌[10].此后,其他研究者陸續(xù)報(bào)道了稻田、濕地、湖泊、海洋沉積物及活性污泥中該類(lèi)反硝化過(guò)程的發(fā)生,研究表明此過(guò)程是典型厭氧環(huán)境中鐵、氮循環(huán)的重要步驟[11-13].

目前,關(guān)于亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原過(guò)程及其微生物的研究還處于起步階段[14-15],針對(duì)微污染水源水利于此類(lèi)功能菌強(qiáng)化脫氮的研究工作還鮮見(jiàn)報(bào)道.

本文從西安市李家河和黑河水庫(kù)底泥中馴化篩分出一組能夠在低C/N條件下高效脫氮的亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群命名為 Z13.利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定確定該菌群的種群結(jié)構(gòu),并對(duì)其反硝化特性及環(huán)境因素對(duì)反硝化效率的影響進(jìn)行研究,以期為亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群應(yīng)用于工程實(shí)踐提供理論依據(jù),為微污染水源水的原位生物脫氮研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年7月取自陜西省西安市李家河水庫(kù)和黑河水庫(kù),采用彼得森[16]采泥器采集水庫(kù)表層0～10cm 沉積物[17],裝于滅菌的取樣瓶中,放置在裝有冰袋的泡沫箱內(nèi), 48h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,待用.

1.2 培養(yǎng)基的配置[18]

富集培養(yǎng)基: CH3COONa 0.3g/L;NaNO30.3g/L;KH2PO40.15g/L; FeSO4·7H2O 0.45g/L; MgSO4·7H2O 0.15g/L;CaCl20.15g/L;微量元素 2mL/L; pH 6.5～6.8.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:CH3COONa 0.1g/L;NaNO30.1g/L;KH2PO40.05g/L; FeSO4·7H2O 0.15g/L; MgSO4·7H2O 0.05g/L;CaCl20.05g/L;微量元素 2mL/L;pH 6.5～6.8.

固體培養(yǎng)基:除添加 10g瓊脂外,其他與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同.

微量元素主要成分:MgSO4·7H2O 0.5g/L; EDTA 1.0g/L ; ZnSO40.2g/L ; MnCl2·4H2O 0.1g/L; FeSO4·7H2O 0.5g/L; CuSO4·5H2O 0.5 g/L; CoCl2·6H2O 0.2g/L.

1.3 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群的篩選

取李家河和黑河水庫(kù)沉積物的混合樣品250mL于500mL的培養(yǎng)瓶中,剩余部分用已滅菌的富集培養(yǎng)液填滿(mǎn),蓋上軟橡皮塞,搖晃鹽水瓶使瓶中樣品混勻,置于恒溫培養(yǎng)箱(30℃)中培養(yǎng).以 7d為 1個(gè)培養(yǎng)周期更換一半的培養(yǎng)基,期間每天搖晃 1次鹽水瓶.

馴化3周后,取1mL沉積物加入9mL的無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋,稀釋梯度分別為 10-2、10-3、10-4、10-5,取以上稀釋梯度的菌懸液0.1mL涂布于固體培養(yǎng)基的平板上[19],再將已滅菌還未凝固的固體培養(yǎng)(30～40℃)覆蓋在已涂布的固體平板上形成雙層平板,置于恒溫培養(yǎng)箱(30℃)中培養(yǎng).3～7d后根據(jù)菌落的生長(zhǎng)情況,將平板上的菌落挑選至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng).對(duì)經(jīng)多次轉(zhuǎn)接依舊能保持高效脫氮的反硝化混合菌群置于甘油中在-20℃保存.

1.4 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群結(jié)構(gòu)分析

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Z13菌液500mL經(jīng)已煮沸滅菌的0.22μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾,采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)對(duì)反硝化混合菌群進(jìn)行 DNA 提取[17].利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取物的質(zhì)量.以基因組DNA為模板,采用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系包括(20μL):DNA模板10ng、338F引物0.8μL(5μmol/L)、806R 引物 0.8μL(5μmol/L)、dNTPs 2μL(2.5mmol/L)、DNA 聚合酶 0.4μL、緩沖液 4μL、BSA 0.2μL、ddH2O 補(bǔ)至 20μL.擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3min,95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,72℃終延伸 10min,循環(huán) 27次.擴(kuò)增后的 PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒回收(Axygen, USA),用Tris-HCl進(jìn)行洗脫,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),通過(guò) Quanti Fluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega)檢測(cè) PCR產(chǎn)物濃度[20].在上海美吉生物公司完成高通量DNA 測(cè)序.本研究中所有關(guān)于16S rRNA基因測(cè)序的原始數(shù)據(jù)均上傳至 NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心),其編號(hào)為SRP301306.

1.5 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群生長(zhǎng)及脫氮特性研究

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Z13菌液按V/V=10%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有45mL新鮮反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的鹽水瓶(50mL)中,擰緊瓶塞,置于恒溫培養(yǎng)箱(30℃)中培養(yǎng).另設(shè)不加菌液的作為空白對(duì)照組.為避免在單個(gè)鹽水瓶中重復(fù)取樣對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響,實(shí)驗(yàn)中根據(jù)取樣次數(shù)培養(yǎng)15瓶微生物.其中接種的混合菌群 Z13來(lái)自同一批培養(yǎng),基礎(chǔ)培養(yǎng)基也是同一批配制.通過(guò)檢測(cè)總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮、Fe2+的質(zhì)量濃度、pH值、TOC和OD600研究混合菌群Z13的生長(zhǎng)及脫氮特性,每次樣品重復(fù)3次.

1.6 不同因素對(duì)亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群脫氮特性影響

為避免在單個(gè)培養(yǎng)瓶中重復(fù)取樣對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響,實(shí)驗(yàn)中根據(jù)取樣次數(shù)培養(yǎng)15瓶微生物.其中接種的混合菌群 Z13取自同一批培養(yǎng),基礎(chǔ)培養(yǎng)基也是同一批配制.每隔一段時(shí)間檢測(cè)硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮、OD600和Fe2+的質(zhì)量濃度.

1.6.1 溫度對(duì) Z13菌群脫氮影響 依據(jù)大多數(shù)細(xì)菌的溫度適應(yīng)范圍及水源水的實(shí)際水溫條件,將不同的恒溫生化培養(yǎng)箱的溫度分別設(shè)置為 10,15,20,25,30和40℃6個(gè)梯度,將培養(yǎng)瓶分別置于不同的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.6.2 初始pH值對(duì)Z13菌群脫氮影響 依據(jù)大多數(shù)細(xì)菌的pH值適應(yīng)范圍,將反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)整為5.0,6.0,7.0,8.0 4個(gè)梯度,接菌后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.6.3 C/N對(duì)Z13菌群脫氮影響 結(jié)合實(shí)際水體情況及考慮到碳源過(guò)多會(huì)對(duì)實(shí)際水體造成污染等因素,將C/N設(shè)定為0、1.0、1.821和4.0.通過(guò)改變乙酸鈉質(zhì)量濃度來(lái)改變C/N(質(zhì)量比),接菌后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.6.4 Fe2+濃度對(duì)Z13菌群脫氮影響 將Fe2+濃度設(shè)置為 0,5,15,30和 50mg/L 5個(gè)梯度,接菌后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.7 分析方法

細(xì)菌菌密度(OD600),采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在 600nm 的吸光度;總氮(TN)采用堿式過(guò)硫酸鉀消解-紫外分光光度法測(cè)定;硝酸鹽氮(NO3--N)采用紫外分光光度法測(cè)定[21];亞硝酸鹽氮(NO2--N)采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定;氨氮(NH4+-N)采用納氏試劑分光光度法測(cè)定;二價(jià)鐵離子濃度(Fe2+)采用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定;TOC采用總有機(jī)碳測(cè)定儀測(cè)定.除菌密度(OD600)和總氮(TN)測(cè)定不過(guò)濾外,其余水樣測(cè)定需經(jīng)0.22μm的醋酸纖維濾膜過(guò)濾[22],每個(gè)水樣重復(fù)測(cè)定3次.

1.8 Z13菌群反硝化過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析

Monod方程在水處理領(lǐng)域中,其表達(dá)式[23]如下:

兩邊取倒數(shù)得:

式中: V和Vmax分別為硝氮的比降解速率mg/(L·h)和最大比降解速率mg/(L·h);S為碳源濃度;Ks為飽和常數(shù).

由生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)得出 1/V與 1/S關(guān)系,如圖(3),代入上式(1)、(2),得出Vmax與Ks.

2 結(jié)果與分析

2.1 混合菌群Z13種群結(jié)構(gòu)分析

本文通過(guò)高通量 DNA測(cè)序分析測(cè)定混合菌群Z13的群落結(jié)構(gòu)及組成比例.從門(mén)水平上看,細(xì)菌群落主要分布在 Proteobacteria(83.45%)和 Acidobacteriota(14.39%)兩個(gè)門(mén)類(lèi).這與文獻(xiàn)報(bào)道[24-25]的相一致.在屬水平上,混合菌群 Z13的組成如下:Zoogloea(69.25%)、Geothrix (14.39%)、Dechloromonas(5.94%)、Ralstonia (3.46%)、Curvibacter (1.16%)、Caulobacter (0.48%)和others (5.32%),其中屬于亞鐵氧化菌的 Zoogloea占比最大,其次是 Fe(III)還原菌Geothrix.這與陳鵬程等[26]報(bào)道的相一致.混合菌群Z13培養(yǎng)至末期時(shí),90%以上的Fe(II)已經(jīng)被氧化(圖2),因此推測(cè) Fe(III)的積累有可能激活了鐵還原菌,發(fā)生 Fe(III)的還原溶解[26].本研究通過(guò)馴化篩選得到混合菌群 Z13,研究其脫氮特性,此過(guò)程中所得到的菌群是自然配對(duì)形成的,相比傳統(tǒng)篩選的純菌具有更好的適應(yīng)能力[19],由不同種屬的亞鐵氧化硝酸鹽還原菌組成的混合菌群更有利于水體中氮素的去除.

圖1 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群Z13群落結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Community structure composition of mixed bacteria Z13 reduced by ferrous oxide nitrate

2.2 混合菌群Z13生長(zhǎng)及脫氮特性分析

如圖2所示,在0～8h階段,混合菌群Z13處于緩慢期,培養(yǎng)基中乙酸鈉消耗速度較慢,硝酸鹽氮濃度由原來(lái)的16.310mg/L降至15.241mg/L. Fe2+加入培養(yǎng)基之后溶液的pH值快速下降,故0h測(cè)得pH值為5.985,之后8h內(nèi)由于Fe2+繼續(xù)水解使得pH值繼續(xù)下降至 5.395.此階段接菌組和空白對(duì)照組對(duì) Fe2+的去除也比較緩慢.隨著混合菌群對(duì)環(huán)境的適應(yīng),在8～22h階段,混合菌群 Z13進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,期間乙酸鈉消耗逐漸加快,培養(yǎng)基逐漸由清澈變的渾濁,說(shuō)明微生物在此階段大量消耗乙酸鈉進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,OD600急劇增加,反硝化作用明顯加強(qiáng),硝酸鹽氮濃度由 15.241mg/L降至 0.808mg/L.對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率為1.0310mg/(L·h).亞硝酸鹽氮濃度在22h達(dá)到最大值 1.684mg/L,之后隨著反硝化的進(jìn)行逐漸降低.因反硝化期間會(huì)產(chǎn)生堿度,使得pH值從5.395升至7.510.此階段細(xì)菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的氧化鐵能力,接菌組的Fe2+濃度快速下降,由26.610mg/L降至5.980mg/L,Fe2+氧化率明顯高于空白對(duì)照組.說(shuō)明培養(yǎng)基中Fe2+的氧化和氮素的去除與菌體生長(zhǎng)有直接關(guān)系,且反硝化作用主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,隨著菌體的快速增殖,培養(yǎng)液中硝酸鹽氮和 Fe2+的量會(huì)迅速下降,這與郭端強(qiáng)等[27],康鵬亮等[28]的研究結(jié)果相一致.在22～50h階段,混合菌群Z13進(jìn)入細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期,此時(shí)乙酸鈉消耗速率逐漸降低,亞硝酸鹽氮也逐漸降低.50h后,培養(yǎng)基中乙酸鈉和 Fe2+已經(jīng)耗盡,細(xì)胞內(nèi)殘存的有機(jī)物不足以支撐微生物繼續(xù)增長(zhǎng),因此數(shù)量開(kāi)始下降. 78h時(shí)空白對(duì)照組的氮素并未去除,而接菌組的硝酸鹽氮的去除率為 99.85%,總氮去除率和平均去除速率為89.91%和0.1888mg/(L·h).由于總氮測(cè)定中包含了微生物同化的氮,故總氮的減少主要源于微生物反硝化作用,在本研究中總氮的減少程度即代表了反硝化脫氮的效果.TOC從初始的29.150mg/L降低至2.140mg/L,去除率和平均消耗速率分別為 92.66%,0.3462mg/(L·h).TOC 濃度的變化與上述氮素濃度的變化具有類(lèi)似的趨勢(shì).整個(gè)反硝化過(guò)程中,無(wú)氨氮的積累,亞硝酸鹽氮在反硝化前期有個(gè)短暫的積累,但很快消失.隨著 Fe2+被大量氧化,培養(yǎng)基中生成了許多絮狀的沉淀.此現(xiàn)象與周志華等[29]的研究一致.因培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)并不是絕對(duì)厭氧的環(huán)境,故空白對(duì)照組 Fe2+的氧化主要為化學(xué)氧化,接菌組 Fe2+的總?cè)コ蕿?99.86%,其中生物氧化率為82.70%,微生物調(diào)節(jié)的 Fe2+氧化可能比非生物的Fe2+氧化進(jìn)行的更快,有研究表明[30]鐵氧化菌的參與可以使得Fe2+的氧化速率提高4個(gè)數(shù)量級(jí). Straub等[31]的研究中也證明了這種機(jī)制的存在.

圖2 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群Z13氮素、TOC、Fe2+濃度去除及pH值與生長(zhǎng)曲線Fig.2 Removal of nitrogen, TOC, Fe2+ concentration and pH value and growth curve of mixed bacteria Z13 by reduction of ferrous nitrate

由圖3可知,混合菌群Z13在生長(zhǎng)的過(guò)程中,硝氮的最大降解速率Vmax為1.290mg/(L·h),飽和系數(shù)Ks為41.606mg/L.

圖3 1/V和1/S的關(guān)系Fig.3 The relationship between one over V and one over S

2.3 理化因素對(duì)混合菌群Z13脫氮特性影響

2.3.1 溫度對(duì) Z13菌群脫氮影響 如圖 4所示,溫度對(duì)反硝化混合菌群Z13的脫氮效果影響顯著.10℃條件下,混合菌群 Z13反硝化進(jìn)程相對(duì)緩慢,細(xì)菌活性較差,代謝速率較低,菌密度也較低,從而影響了反硝化速率和Fe2+的生物氧化效果. 78h時(shí)硝酸鹽氮去除率為 19.03%,亞硝酸鹽氮的累積為0.978mg/L,此時(shí)Fe2+的總?cè)コ蕿?0.07%,生物氧化率為 26.94%.15℃條件下混合菌群 Z13在 78h時(shí)的硝酸鹽氮去除率為 54.58%,Fe2+的總?cè)コ蕿?7.31%.亞硝酸鹽氮在44h到達(dá)最大1.180mg/L,78h時(shí)降為 0.643mg/L.20℃條件下混合菌群 Z13在78h的硝酸鹽氮去除率為81.12%,Fe2+的總?cè)コ蕿?96.35%,亞硝酸鹽氮的累積為 0.234mg/L.菌密度和Fe2+的去除效果隨溫度的升高也逐漸增加,在 25～40℃溫度范圍內(nèi) 78h時(shí)硝酸鹽氮去除率均在 94%以上,且反硝化結(jié)束后也無(wú)亞硝酸鹽氮和氨氮的累積.此范圍內(nèi) Fe2+的化學(xué)去除率為15.96%～22.52%.混合菌群Z13在40℃的條件下亞硝酸鹽氮累積量在 12h達(dá)到最大 0.354mg/L,而30℃條件下亞硝酸鹽氮累積量在 22h達(dá)到最大1.684mg/L.說(shuō)明不同的溫度下混合菌群 Z13脫氮速率差異明顯,且在一定范圍內(nèi),溫度越高,微生物的活性越高,增殖速度越快[23]. 10～40℃溫度范圍內(nèi),整個(gè)反硝化過(guò)程中都未檢測(cè)到氨氮的生成,由菌密度可看出40℃條件下的混合菌群Z13比其他組更早進(jìn)入對(duì)數(shù)期,但穩(wěn)定期明顯縮短,提前進(jìn)入衰亡期,說(shuō)明在較高溫度之下雖然有助于細(xì)菌的分裂生殖但也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌迅速進(jìn)入衰亡期,細(xì)胞活性迅速下降.相比而言 30℃時(shí)混合菌群 Z13既能夠迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期快速分裂生殖,并且最終培養(yǎng)基中也能夠獲得較高的細(xì)菌密度.因此,所有混合菌群Z13的預(yù)培養(yǎng)及活化過(guò)程均在30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行.故本文中混合菌群Z13最佳的培養(yǎng)溫度為30℃.

圖4 溫度對(duì)Z13菌群脫氮影響Fig.4 Effect of temperature on denitrification of Z13bacteria

混合菌群 Z13對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬,在 25～40℃溫度范圍內(nèi)脫氮性能良好,這與已報(bào)道的其它亞鐵氧化硝酸鹽還原菌相類(lèi)似[32],這樣的寬溫度范圍有利于菌體在環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)與存活,并能夠有效地發(fā)揮該菌的反硝化能力.

2.3.2 初始pH值對(duì)Z13菌群脫氮影響 由圖5可知,培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)混合菌群Z13脫氮有顯著的影響,在初始pH值為5的酸性環(huán)境中,Fe2+溶解性良好且穩(wěn)定,但大多數(shù)反硝化生物活性會(huì)被抑制.故菌體生長(zhǎng)緩慢,脫氮速率也較低,由菌密度可看出細(xì)菌適應(yīng)期較長(zhǎng).50h后,混合菌群 Z13才適應(yīng)環(huán)境開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期.78h時(shí)硝酸鹽氮去除率為93.80%,亞硝酸鹽氮的累積量為 1.123mg/L,在初始pH值為6的條件下,混合菌群Z13在44h時(shí)亞硝酸鹽氮的累積量達(dá)到最大為 1.785mg/L,78h時(shí)降為0.428mg/L,同時(shí)硝酸鹽氮的去除率為 93.80%.由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出初始pH值為5和6的情況下,混合菌群Z13生長(zhǎng)緩慢,78h時(shí)反硝化進(jìn)程還未結(jié)束.

圖5 初始pH值對(duì)Z13菌群脫氮影響Fig.5 Effect of initial pH on denitrification of Z13 bacteria

當(dāng)初始pH值為7和8時(shí),混合菌群Z13活性較高,脫氮速率更迅速,微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶的活力都較高[33].22h時(shí),硝酸鹽氮去除率達(dá)到94.57%和 95.62%.Fe2+總?cè)コ蔬_(dá)到 99.95%和99.93%.生物去除率為84.42%和82.83%,化學(xué)去除率為15.53%和17.10%.pH值在7～8范圍內(nèi)時(shí)Fe2+易被氧化,混合菌群Z13必須與非生物鐵氧化過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)二價(jià)鐵源.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,混合菌群Z13對(duì)中性和弱堿性環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),相應(yīng)的反硝化效果也較好.

pH值在5～8范圍內(nèi)時(shí)混合菌群 Z13均可進(jìn)行反硝化,說(shuō)明混合菌群Z13能夠適應(yīng)的pH值范圍很寬,對(duì) pH 的耐受能力很強(qiáng),且整個(gè)反硝化過(guò)程中并未監(jiān)測(cè)到 NH4+的生成.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合菌群 Z13的菌體生長(zhǎng)及亞鐵氧化和反硝化速率都與pH值呈較強(qiáng)的相關(guān)性.在一定的范圍內(nèi),隨著 pH 值的升高,菌密度也逐漸增加,反硝化速率逐漸加快.22h時(shí),混合菌群Z13在pH=8時(shí)的硝酸鹽氮去除率是pH=6時(shí)的 6.54倍.文獻(xiàn)[34-35]中提到已發(fā)現(xiàn)的不同類(lèi)型的亞鐵氧化硝酸鹽還原菌適宜生長(zhǎng)的pH值范圍具有一定的差異,最適的培養(yǎng) pH值范圍也并不統(tǒng)一,有的在pH值為6.5～7.5之間具有最佳的生長(zhǎng)速率.本文中的反硝化菌群Z13的最適初始pH值范圍為6.5～8.其中最佳初始pH值為6.5.

2.4.3 C/N對(duì)Z13菌群脫氮影響 在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)作為能源的有機(jī)碳源質(zhì)量濃度越高,反硝化菌群的反硝化速率就越快[36].

由圖6可知C/N為0時(shí),78h時(shí)硝酸鹽氮去除率為 19.30%, Fe2+的總?cè)コ蕿?36.83%.由此可見(jiàn),在不提供有機(jī)碳源的情況下, Fe2+作為唯一的電子供體,所提供的能量并不能滿(mǎn)足菌體的生長(zhǎng),混合菌群Z13生長(zhǎng)緩慢,活性和菌密度較低,脫氮性能及氧化Fe2+的能力也較低.當(dāng)C/N增加為1時(shí),78h時(shí)硝酸鹽氮去除率為53.72%, Fe2+的總?cè)コ蕿?7.55%,生物去除率為 61.30%.表明添加少量的有機(jī)物作為共同電子供體時(shí),相比僅使用 Fe2+做為電子供體,反硝化菌群的脫氮性能有所提升且亞鐵氧化率也顯著提高.這與文獻(xiàn)[10,12]中的研究結(jié)果相一致.繼續(xù)提高C/N為1.821,78h時(shí)硝酸鹽氮去除率為99.85%, Fe2+的總?cè)コ蕿?99.86%,其中生物氧化率為 88.30%,且亞硝酸鹽氮的累積量達(dá)到最大值的時(shí)間也比C/N為1時(shí)提前,菌密度也有所增加.由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,在C/N小于1.821時(shí),混合菌群Z13脫氮效率隨著C/N的增加而快速增長(zhǎng),這主要是因?yàn)槌跏嫉奶荚丛匠渥?反硝化菌群的生長(zhǎng)速度越快.為進(jìn)一步探究高C/N對(duì)混合菌群脫氮效率的影響以及考慮到資源浪費(fèi)的問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)將 C/N最高定為 4.此時(shí)混合菌群Z13的脫氮效率及Fe2+去除率基本不再增加而是處于平穩(wěn)的狀態(tài),相比其他情況,脫氮速率有所增加,反硝化過(guò)程中亞硝酸鹽氮的累積量也逐漸減少, 22h時(shí)最大累積量?jī)H為0.244mg/L之后又快速消失,菌體的穩(wěn)定期延長(zhǎng).因此,當(dāng)C/N在0～4之間變化時(shí),混合菌群Z13的亞鐵氧化率及脫氮效率隨有機(jī)碳源的增加而增加,但當(dāng)提供的碳源遠(yuǎn)高于混合菌群的需求時(shí),此時(shí)碳源已非限制性因素,混合菌群的生長(zhǎng)和代謝活性處于穩(wěn)定階段,反硝化脫氮效率則不再增加而是處于基本穩(wěn)定狀態(tài),此現(xiàn)象與文獻(xiàn)[37]報(bào)道的相一致.且整個(gè)反硝化過(guò)程中并未檢測(cè)出NH4+的生成,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,最佳的C/N為1.821.混合菌群Z13的貧營(yíng)養(yǎng)特性為其將來(lái)應(yīng)用于水源水生物脫氮?jiǎng)?chuàng)造了有利條件.

圖6 C/N對(duì)Z13菌群脫氮影響Fig.6 Effect of C/N on denitrification of Z13 bacteria

2.3.4 Fe2+濃度對(duì)Z13菌群脫氮影響 圖7中,不加Fe2+時(shí),78h時(shí)硝酸鹽氮的去除率為87.31%,亞硝酸鹽氮的累積量為 3.721mg/L.此時(shí)乙酸鈉作為唯一的有機(jī)碳源供菌群生長(zhǎng)利用,其中硝酸鹽氮的去除主要是通過(guò)反硝化完成[38],由于未加亞鐵,電子供體不足使得當(dāng)乙酸鈉被消耗完之后微生物無(wú)可利用的物質(zhì),反硝化進(jìn)行不完全,故會(huì)有亞硝酸鹽氮的累積.混合菌群Z13在初始Fe2+濃度為5mg/L條件下,78h時(shí)硝酸鹽氮的去除率為 91.95%,亞硝酸鹽氮累積量為 2.25mg/L.Fe2+濃度為15mg/L時(shí)混合菌群Z13在78h時(shí)硝酸鹽氮的去除率為 95.96%,亞硝酸鹽氮累積量為1.603mg/L.說(shuō)明Fe2+濃度為0～15mg/L時(shí),還是不足以使反硝化進(jìn)行完全.但是隨著 Fe2+濃度的增加,硝酸鹽氮的去除率也逐漸增大,亞硝酸鹽氮累積量逐漸減小.這表明,微生物很可能利用了 Fe2+作為電子供體進(jìn)行硝酸鹽的還原,這與 Liu等[39]人文獻(xiàn)中所報(bào)道的相一致.雖然 Fe2+與亞硝氮可發(fā)生化學(xué)反應(yīng),但是已有研究證明[40]在亞鐵氧化硝酸鹽還原過(guò)程中, 亞硝氮的還原過(guò)程存在生物和非生物共同作用,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.當(dāng)Fe2+濃度為30和50mg/L時(shí), 78h時(shí)混合菌群Z13反硝化作用完全,無(wú)亞硝酸鹽氮的累積.這表明混合菌群Z13對(duì)硝酸鹽還原時(shí),亞硝酸鹽氮是中間產(chǎn)物而不是最終產(chǎn)物,并且過(guò)程中未出現(xiàn)較高濃度的積累,生成后很快被繼續(xù)還原[41],且全程并未檢測(cè)出NH4+的生成.加入的 Fe2+濃度在 5～50mg/L 時(shí),混合菌群Z13在78h內(nèi)對(duì)Fe2+總?cè)コ士蛇_(dá)到98.0%以上,生物去除率能夠保持在82.70%以上.由此可見(jiàn)混合菌群Z13對(duì)Fe2+去除效果表現(xiàn)出穩(wěn)定而高效的能力,這與周志華等[29]的研究結(jié)果相一致.考慮到經(jīng)濟(jì)性問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)Fe2+最佳加入量為30mg/L.

圖7 Fe2+濃度對(duì)Z13菌群脫氮影響Fig.7 Effect of Fe2+ concentration on denitrification of Z13 bacteria

3 結(jié)論

3.1 本文從李家河和黑河水庫(kù)底泥中馴化篩選出在低C/N條件下能夠高效脫氮的亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群 Z13.經(jīng)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析表明Z13菌群主要含有 Zoogloea、Geothrix、Dechloromonas、Ralstonia、Curvibacter、Caulobacter等菌屬,為微污染水源水的原位生物脫氮提供菌源保障.

3.2 亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群 Z13在低 C/N條件下能夠高效脫氮, 78h時(shí)硝酸鹽氮去除率和平均去除速率為99.85%和0.2087mg/(L·h),總氮去除率和平均去除速率為89.91%和0.1888mg/(L·h).Fe2+的總?cè)コ蕿?9.86%,其中生物氧化率為82.70%,無(wú)亞硝酸鹽氮和氨氮的累積.

3.3 在溫度 30℃,pH 6.5,C/N 1.821, Fe2+濃度30mg/L時(shí),亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群Z13對(duì)亞鐵氧化和氮素的去除效果最好,為亞鐵氧化硝酸鹽還原混合菌群Z13在微污染水體生物脫氮提供科學(xué)依據(jù).