固態發酵葛根渣制備葛根素

張帥，羅靜怡，唐婷范，程昊*，劉承耀

（1.肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526601；2.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州螺螄粉工程技術研究中心，廣西 柳州 545006；3.蔗糖產業省部共建協同創新中心，廣西 南寧 530004；4.濟南市第六人民醫院/濟寧醫學院附屬章丘區人民醫院骨關節科，山東 濟南 250200）

葛根（Radix puerariae）是多年生落葉藤本植物野葛或甘葛藤的塊根[1]。野葛[Pueraria lobata（Willd.）O－hwi]和粉葛（P.thomsonii Benth.）是最具代表性的兩種葛根，由于含有異黃酮和淀粉因而具有藥食兩用特性[2]。廣東和廣西主要分布的是粉葛，粉葛淀粉含量高，因而主要用于食品工業中葛粉的生產[3]。葛粉加工后會產生大量的副產物葛根渣，葛根渣通常是作為廢棄物被填埋或焚燒，有時會用作花卉植物和食用菌的栽培料，利用價值很低且易造成環境污染[4-5]。

葛粉加工主要是將葛根淀粉提取出來，異黃酮損失很小，因而葛根渣中通常含有大量異黃酮[6]。葛根異黃酮的主要成分是葛根素，葛根素是大豆苷元的8-C-葡萄糖苷[7]，具有廣泛的藥理作用，如舒張血管、保護心臟和神經、抗氧化、抗炎癥、止痛、促進骨形成、提高細胞免疫力、減輕胰島素抵抗等，臨床上已用于心腦血管疾病、糖尿病及并發癥、骨壞死、帕金森、阿爾茨海默、子宮內膜異位及癌癥的治療[8-14]。

提取葛根素的常規方法是醇提法[15-17]。由于葛根細胞壁的纖維素及半纖維素組成的結晶結構能阻礙葛根素的有效溶出，因而醇提法雖然簡單易行，但葛根素提取率較低[18-19]，目前僅限于實驗室研究。為了破壞細胞壁的纖維結構，使葛根素易于溶出，先加入纖維素酶進行水解，然后再提取葛根素，可顯著提高產品得率。然而纖維素酶目前價格還比較高，因此采用酶法提取葛根素生產成本較高，難以實現規?；I生產。

本研究利用黑曲霉菌株固態發酵葛根渣高效制備葛根素。通過微生物自身酶系對植物細胞壁的酶解作用來增強細胞通透性，從而提高葛根素的提取率。將發酵產物用乙醇提取以獲得葛根素粗提物，最后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測粗提物中葛根素的含量。通過微生物發酵技術獲得葛根素，生產成本低，產品得率高，發酵后的培養基殘渣還可用作肥料，因而有望實現產業化。本研究對于促進我國葛根及相關產業的發展具有重要意義，也可為其他天然活性產物的高效制備提供方法參考和技術示范。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：黑曲霉，肇慶學院食品與制藥工程學院食品微生物實驗室4℃冰箱保藏；葛根渣：柳州市葛源貿易有限責任公司，105℃烘干至恒重后粉碎，過50目篩。粉末狀葛根渣封袋備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）（粉末狀商品）：廣東環凱微生物科技有限公司，按說明書配好后分裝試管，滅菌后做成PDA斜面若干，冷藏備用。

固態發酵培養基：葛根渣8.0g，麩皮3.0g（渣麩質量比8∶3），NH4NO30.85g，MnCl20.05g，MgSO4·7H2O0.005g，KH2PO40.005 g，水8.3 g（約占固體成分質量的70%）。

葛根素標準品（色譜純）：成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DGX-9143 B-1電熱恒溫鼓風干燥箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司；HH-6數顯恒溫水浴箱：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；LC-2030高效液相色譜儀（配套SPD-10A紫外檢測儀）：日本島津公司；XB-10B高速多功能粉碎機：東莞市隆鑫機電設備有限公司；H-1850臺式高速離心機：湘潭湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉菌懸液制備

將黑曲霉劃線接種于PDA斜面，30℃培養72 h后斜面長滿黑色孢子。無菌條件下，取1環孢子接入10 mL已滅菌的含0.1%吐溫-80的0.85%生理鹽水中搖勻，即得黑曲霉菌懸液。

1.3.2 固態發酵葛根渣

取250 mL錐形瓶若干，分別裝入固態發酵培養基，滅菌后分別接入1 mL黑曲霉菌懸液，振蕩錐形瓶使菌懸液盡量均勻分布于培養基中30℃發酵。不同錐形瓶分別發酵 24、48、72、96、120、144、168h，然后分別提取葛根素并測定發酵物料的木聚糖酶和CMC酶活力。

1.3.3 木聚糖酶和CMC酶活力測定

參考施英英等[20]的測定方法，一個木聚糖酶活力國際單位（IU）表示每分鐘降解反應底物木聚糖釋放1.0 μmol還原糖（以木糖計）所需的酶量；以羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，CMCNa）作為底物測定CMC酶的活力，1個酶活力單位（U）定義為在50℃、pH4.8條件下每小時降解底物生成1.0 mg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量。

1.3.4 葛根素提取

發酵結束后，取出一半發酵物料置于另一250 mL錐形瓶中，在兩個發酵物料錐形瓶中各加入70%乙醇溶液100 mL，搖勻后置于80℃恒溫水浴中提取180 min，期間每30 min振搖一次錐形瓶。最后將瓶內物料進行抽濾，濾液合并即為葛根素粗提液。

1.3.5 葛根素HPLC檢測

1.3.5.1 樣品預處理

將葛根素粗提液置于高速離心機中，10 000 r/min離心20 min后，收集上清液，共得170 mL。上清液經0.22 μm濾膜過濾后，進樣高效液相色譜儀檢測。

1.3.5.2 葛根素標準曲線的建立

先將葛根素標準品用30%乙醇溶液配制成濃度為1.0 mg/mL的葛根素標準品溶液，然后按0.001、0.010、0.200、0.400、0.600、0.800 mg/mL 的濃度梯度稀釋。以葛根素標準品溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標建立標準曲線。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS型C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相：甲醇-水（體積比 30∶70），檢測波長250nm，流速1mL/min，進樣量10μL，恒定柱溫30℃。

1.3.5.4 發酵葛根渣所得葛根素含量的計算

求出樣品色譜峰面積，代入葛根素標準曲線方程求出樣品中葛根素濃度Cx，則發酵葛根渣所得葛根素含量：C1/（mg/g）=（170×Cx）/8.0。

1.3.6 葛根渣直接醇提葛根素及檢測

稱取葛根渣4.0 g置于250 mL錐形瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL提取葛根素，操作方法同1.3.4。獲得的葛根素粗提液按1.3.5.1預處理后共收集到75 mL。葛根素HPLC檢測色譜條件同1.3.5.3。求出樣品色譜峰面積，由葛根素標準曲線方程求出葛根素濃度Cy，則葛根渣直接醇提的葛根素含量：C2/（mg/g）=（75×Cy）/4.0。

2 結果與分析

2.1 葛根渣固態發酵產葛根素和產酶進程

葛根渣固態發酵不同時間產葛根素進程如圖1所示，產酶（木聚糖酶和CMC酶）進程如圖2所示。

圖1 固態發酵葛根渣產葛根素進程Fig.1 Puerarin production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

圖2 固態發酵葛根渣產酶進程Fig.2 Enzyme production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

木聚糖酶能夠降解葛根細胞壁中的半纖維素[21]，而CMC酶則可以將細胞壁纖維素分解[22]，二者協同作用可進一步提高葛根細胞壁的通透性[3]，從而加速胞內葛根素的溶出。由圖1和圖2可知，產葛根素進程與產酶進程二者密切相關。發酵24 h時培養基內僅生成少量白色菌絲，此時產酶很低，對葛根細胞壁通透性的影響較小，因此測得的葛根素含量基本等同于直接醇提葛根渣獲得的葛根素。隨著發酵時間的延長，菌絲增加、孢子生成，酶活力迅速提升，葛根細胞壁通透性不斷加強，葛根素含量亦不斷提高。當發酵72 h時，培養基內已長滿黑色孢子，CMC酶活力達到最高值1 274 U/g，發酵96 h時，木聚糖酶活力達到最高值8 825 IU/g，繼續發酵，隨著菌體的老化，酶活力逐漸下降。由于酶對細胞壁的降解破壞作用是累積的，因此葛根素含量達到最高值需要比酶活力達到最高值更長的發酵時間，當發酵至120 h時，葛根素含量已接近最大值，繼續發酵，葛根素含量雖略有提高，但曲線已趨于平穩，說明葛根素已最大程度溶出。

2.2 葛根素HPLC檢測結果

2.2.1 葛根素標準曲線

不同濃度的葛根素標準品溶液的HPLC圖如圖3所示。

圖3 葛根素標準品溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC chart of puerarin standard solution

基于葛根素濃度和色譜峰面積建立的葛根素標準曲線方程：y=46 053 070.57x-25 078.99，校正系數R2=0.999 86，表明方程線性擬合良好。

2.2.2 葛根渣中葛根素含量

固態發酵葛根渣120 h后，發酵物料中的葛根素HPLC檢測結果如圖4所示。直接醇提葛根渣所得葛根素HPLC色譜圖如圖5所示。

圖4 葛根渣發酵后醇提液葛根素的HPLC圖Fig.4 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue after fermentation

圖5 葛根渣醇提液葛根素的HPLC圖Fig.5 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue

由圖4可知，根據樣品色譜峰面積，求得葛根素含量為5.68 mg/g。由圖5可知，根據樣品色譜峰面積，求得葛根素含量為3.25 mg/g?？梢?，由于黑曲霉固態發酵葛根渣產生的木聚糖酶、CMC酶對葛根細胞壁纖維結構的降解破壞作用，使得葛根渣發酵后醇提液中的葛根素含量比直接醇提葛根渣所得葛根素提高了74.8%。

3 結論

本文研發了一項利用葛根加工廢棄物葛根渣來高效制備葛根素的技術。用黑曲霉對葛根渣進行固態發酵，產生的木聚糖酶和CMC酶可以降解葛根細胞壁的半纖維素和纖維素，達到破壞細胞壁纖維結構、增大細胞壁通透性從而使葛根素易于溶出的目的。8.0 g葛根渣經固態發酵120 h后，利用HPLC檢測的葛根素含量高達5.68 mg/g，比直接醇提葛根渣獲得的葛根素含量提高了74.8%，實現了葛根素的高效制備。