利用葉綠素熒光動力學參數識別苗期番茄干旱脅迫狀態

龍 燕，馬敏娟，王英允，宋懷波

（1.西北農林科技大學機械與電子工程學院，楊凌 712100；2.農業農村部農業物聯網重點實驗室，楊凌 712100；3.陜西省農業信息感知與智能服務重點實驗室，楊凌 712100）

0 引 言

水分對作物的生長至關重要，水分虧缺會造成作物的水勢和膨壓低于正常水平，使其正常代謝機能受到干擾或破壞，嚴重威脅作物的生長發育[1]。干旱作為一種多維脅迫，可以引起作物表型、生理學、生物化學和分子水平的變化，嚴重時將導致光合作用終止和代謝紊亂，最終導致作物死亡[2]。因此，及時識別作物干旱脅迫程度，對作物生長發育、合理灌溉和產量提升都具有重大意義。

目前，檢測作物所受脅迫程度的方法主要分為基于生理特性指標[3-7]（植物莖流、水勢、蒸騰速度、莖體水分）和基于形態[8-10]（2D圖像、3D圖像、光譜特征）兩類。雖然利用生理特征指標可以得到較高的檢測精度，但其操作復雜，對作物會造成不同程度的損傷。而基于形態的檢測方法以無損、快速的優點被廣泛用于作物脅迫程度識別。其中葉綠素熒光成像技術能反映葉片對光能的吸收和轉化、能量的傳遞和分配以及反應中心狀態等作物光合作用信息[11]，利用葉綠素熒光參數可在肉眼看到癥狀前就識別出脅迫特征，已廣泛應用于植物各類脅迫狀態的監測和預警[12]。翁海勇等[13]利用葉綠素熒光參數結合隨機森林算法構建了柑橘不同程度黃龍病的診斷模型，其總體識別正確率為 97.50%。Wang等[14]首次利用葉綠素熒光成像技術和熱紅外成像技術完成對甘薯多種病毒感染的區分，并得到光化學淬滅系數是區分不同病毒的最敏感參數。Dong等[15]利用葉綠素熒光成像技術完成對番茄幼苗冷害的識別。通過計算熒光參數和冷害程度的Person相關性，得到實際光化學量子產量、穩態光適應光化學淬滅系數等 6個熒光參數，可用于評估番茄幼苗的冷害程度，并利用神經網絡構建預測模型，其訓練集、驗證集的識別準確率分別為90.3%、90%。梁歡等[16]通過葉綠素熒光參數對不同品種的紫花苜蓿種質苗期抗旱性進行了對比，從 109份紫花苜蓿中篩選出了14份抗旱高光效種質。Zhou等[17]驗證了葉綠素熒光技術能夠識別植物不同水分和氮素的狀態，并利用支持向量機（Support Vector Machines，SVM）、徑向基函數（Radial Basis Function，RBF）和BP（Back Propagation）神經網絡方法完成對9種不同水氮耦合狀態的分類。Wang等[18]以大豆幼苗為研究對象，分析了在輕度干旱脅迫和重度干旱脅迫下葉綠素熒光參數的變化，得到實際光化學量子產量與干旱程度相關度最高，并利用實際光化學量子產量完成抗旱品種的篩選。

上述研究利用葉綠素熒光技術識別作物非生物脅迫取得一定的成果。但還存在如下問題：1）大部分研究只局限于對暗適應后最小熒光、最大光量子效率等熒光參數進行分析，未能充分利用葉綠素熒光參數信息；2）大部分研究未利用熒光圖像信息，只采集某幾個點的熒光參數作為整個植株葉片的熒光參數，不能完全代表整個植株的熒光信息。因此本研究以苗期番茄為研究對象，基于葉綠素熒光成像技術，采集植株冠層的熒光圖像，將熒光圖像均值作為該植株的熒光參數，從而更準確的代表植株葉綠素熒光信息。同時，研究與干旱脅迫相關的熒光參數選取方法，挖掘具有重要價值的葉綠素熒光參數，提高熒光參數的利用率。最后建立干旱脅迫狀態識別模型，以期實現苗期番茄早期干旱脅迫的監測以及干旱脅迫狀態的判定，為植物健康生長和合理灌溉提供理論依據。

1 試驗和方法

1.1 干旱脅迫試驗

干旱脅迫試驗于西北農林科技大學旱區節水農業研究院人工氣候室進行（北緯 34°07′39″，東經 107°59′50″，海拔648 m），室內光周期為晝/夜14 h/10 h，環境溫度為晝/夜24 ℃/14 ℃，空氣相對濕度為60%。采用盆栽土培法，試驗土壤為進口泥炭土，土壤容重1.1 g/cm3，土壤養分含量為：磷1.52 g/kg，鉀2.64 g/kg，鎂0.28 g/kg，硝態氮0.78 g/kg，銨態氮 0.56 g/kg，pH值6.0，有機質質量分數64%。選取高13 cm，口徑15 cm的塑料盆，每盆裝土0.5 kg。于2020年7月選擇長勢、大小較為一致的70株番茄苗移栽到塑料盆中，每盆1株。移栽當天澆透水，緩苗2 d，第3天再次補充水分，后續不再澆水，直至番茄苗萎蔫。為方便后續建模分析，在每次熒光參數采集之前，使用土壤濕度傳感器測量 3次土壤濕度取平均值作為所測樣本土壤含水率的實際值，將土壤含水率為最大持水量的75%～85%、55%～65%、35%～45%、15%～25%分別記為適宜水分、輕度干旱、中度干旱和重度干旱[19]。

1.2 葉綠素熒光動力學參數采集

本研究使用PlantScreen植物表型成像分析系統（北京易科泰生態技術有限公司）測量葉綠素熒光參數，系統由測量光光源（610～620 nm，紅光）、光化學光光源（610～620 nm，紅光；470～480 nm，藍光）、飽和光光源（470～480 nm，藍光）、暗適應室、計算機以及控制軟件等部件組成。將暗適應30 min的番茄幼苗放入檢測箱中，通過計算機控制程序運行，并利用 FluorCam 7.0軟件采集、分析數據。由于整個番茄植株的葉片高低不同，熒光激發的強度對不同位置的葉片也不同。為避免高低葉位對結果的影響，該研究只選取植株冠層最上層的 3片葉片的熒光圖像為感興趣區域，將感興趣區域的像素均值作為該植株的葉綠素熒光參數值，圖1為不同干旱脅迫狀態下最小熒光參數感興趣區域選取結果。每個樣本共獲取98幅熒光圖像，即共有98個葉綠素熒光參數，參數符號和參數名稱如表1所示。

表1 98個葉綠素熒光參數表Table 1 98 chlorophyll fluorescence parameter table

1.3 數據處理方法

1.3.1 數據歸一化

數據歸一化也就是數據無量綱化處理，主要解決數據的可比性。將原始數據均轉換為無量綱化指標測評值，即各指標值都處于同一個數量級別上，可以有效提高數學模型的準確性[20]。本研究選擇較為常用的線性歸一化方法對各參數進行歸一化處理[21]。

1.3.2 特征參數提取

對所獲取的98個葉綠素熒光參數做Person相關性分析可得，98個熒光參數之間存在不同程度的相關性，如圖2所示，其中相關系數絕對值大于0.6的占比大于40%，相關系數絕對值最高可達0.934。表明各參數間存在冗余信息。

為挖掘具有重要價值的熒光參數，并簡化干旱脅迫識別模型復雜度，降低計算時間，增強模型泛化能力，提高識別準確率，本文分別采用連續投影法（SuccessiveProjections Algorithm，SPA）、迭代保留信息變量法（Iteratively Retains Informative Variables，IRIV）和變量空間迭代收縮法（Variable Iterative Space Shrinkage Approach，VISSA）對葉綠素熒光參數進行優選。

SPA算法是一種前向循環變量選擇方法，能夠有效的選擇特征變量，降低數據維度[22]。該方法先設定選取參數個數的最大值和最小值，然后循環迭代，計算該變量在其他未被選入變量上投影的大小，將投影向量最大的變量引入到變量組合中，建立偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）回歸模型，通過計算不同參數組合得到的均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE），直至特征參數的數目達到最小RMSE對應的數值，循環結束[23]。

IRIV算法是云永歡等[24]于 2014年提出的一種特征變量選擇方法。該方法通過模型集群分析（Model Population Analysis，MPA），將全部變量劃分為強信息、弱信息、無信息和干擾信息變量。通過剔除干擾信息變量和無信息變量，保留強信息變量和弱信息變量，最后通過反向消除策略對剩下的強信息變量和弱信息變量進行反向消除，剩余變量即為特征變量。

VISSA算法是基于 MPA 和加權二進制采樣（Weighted Binary Matrix Sampling，WBMS）。首先，使用WBMS從原始數據集中提取一些子訓練數據集，然后建立變量子集的PLS模型。對不同子模型的交互驗證均方根誤差（Root Mean Square Error of Cross-Verification，RMSECV）值進行排序以獲得最佳模型，提取最佳模型并獲得新的子訓練數據集。重復上述過程，直到所有變量的權重恒定（1或0）。最后得到最佳模型，選擇最優變量集[25]。

1.3.3 建模方法及模型評價

本研究利用線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、支持向量機（Support Vector Machines，SVM）和k 最近鄰（k-Nearest Neighbor，KNN）3種機器學習算法建立干旱脅迫狀態識別模型，并分析其對識別準確度的影響。采用 K-折交叉驗證（K-fold cross validation） 評價模型性能。該研究選擇5折交叉驗證法。在每一折交叉驗證中，從樣本數據中隨機選擇 80%樣本構建訓練集，其余 20%為測試集。對整個數據集計算RMSE，作為模型評估的指標。對所有樣本的識別結果建立全局混淆矩陣，計算準確率。

2 結果與討論

2.1 參數優選

該研究使用SPA、IRIV和VISSA算法對葉綠素熒光參數進行優選，圖3為不同算法的優選過程，表2為不同算法的優選結果。

2.1.1 基于SPA的參數優選

該研究使用 SPA算法對葉綠素熒光參數進行優選時，考慮到計算效率，設定選取參數個數范圍為1～38。參數個數與其對應的 RMSE如圖3a所示。由圖3a可知，RMSE隨著參數個數的增加呈現先下降后基本不變的趨勢，表明參數個數較少時（參數個數小于6），難以代表植物光合作用的全部信息，隨著參數個數不斷增加，RMSE不斷減小，表明SPA所選取的熒光參數包含植物受水分脅迫的重要信息，在建模中起積極的作用。當選取的參數個數大于 12（圖3a中方框所示）后，RMSE基本保持穩定，因此研究共提取12個葉綠素熒光動力學參數。SPA選取的12個參數如表2所示。

2.1.2 基于IRIV的參數優選

在IRIV選擇參數的過程中，采用5折交叉驗證的方式建立PLS模型，以RMSECV為評價指標選擇特征變量。參數選取過程如圖3b所示，經過第1次迭代，參數個數由98降為45，第2、3次迭代后，參數個數穩定在36。通過反向消除無關或干擾參數后，保留了29個葉綠素熒光動力學參數。IRIV選取的29個參數如表2所示。

表2 3種參數優選算法結果Table 2 Three parameter optimization algorithm results

2.1.3 基于VISSA的參數優選

參考文獻[25]，設置VISSA算法中WBMS生成的變量個數為2 000，子模型比例設置為5%，變量的初始權重設置為0.5。并采用5折交叉驗證的方式建立PLS模型，根據不同參數個數下的RMSECV確定最終變量個數。圖3c是RMSECV隨優選參數個數的變化趨勢，由圖3c可知，隨著參數個數的增加，RMSECV呈現先大幅度下降后小幅度增加的趨勢。較少的變量對應的RMSECV較大，表明較少的變量無法準確表達干旱脅迫程度。當參數個數過大時，RMSECV隨之增大，表明此時的參數中包含冗余信息，對建模不利。該研究在RMSECV最小處（圖3c中方框所示）選得25個葉綠素熒光動力學參數。VISSA選取的25個參數如表2所示。

2.1.4 葉綠素熒光參數選取結果分析

根據上述3種參數優選算法，得到了3種葉綠素熒光動力學參數的組合。表2是SPA、IRIV、VISSA所選葉綠素熒光參數的結果比較。可以看出不同算法選取的參數有部分重疊，其中 3種算法都選中的熒光參數有 5個，分別為55號QY_L2、64號NPQ_L3、87號qL_L2、90號 qL_Lss、93號 qL_D3。為更深層次的分析上述 5個熒光參數和干旱脅迫的關系，本文分析了不同干旱程度下這5個熒光參數的變化，如圖4所示。

由圖4可知，QY_L2隨著干旱脅迫程度的增加呈現減小的趨勢，說明干旱脅迫降低了葉片的光化學淬滅能力。NPQ_L3為非光化學淬滅，其反映了光系統Ⅱ吸收的能量用于耗散為熱量的比例，也就是植物耗散過剩光能為熱量的能力，即光保護能力[26]。NPQ_L3隨著干旱脅迫程度的增強而上升說明葉片在干旱脅迫下天然色素通過熱耗散的方式釋放過多的熱量，來減少 PSⅡ吸收的過多光能，從而減緩衰老[27]。qL_L2、qL_Lss、qL_D3均為光化學淬滅，其表明了光系統Ⅱ吸收的能量用于光化學反應的比例，開放態的光系統Ⅱ反應中心所占的比例，反應了光合活性的高低，除qL_Lss在輕度干旱狀態下稍有上升外，其余均隨著干旱脅迫程度增加而降低，表明干旱脅迫導致PSⅡ天然色素捕捉光能分配給電子傳遞速率的值減少[28]。

2.2 干旱脅迫識別模型建立

利用LDA、SVM和KNN建立作物干旱脅迫識別模型。SVM建模選擇種類為二次SVM，核函數為二次方內核，選擇一對一多分類方法。KNN建模選擇種類為加權KNN，設置鄰近數為 10。各建模方法的識別準確率如表3所示。從表3可以看出，98個熒光參數均參與建模時，LDA識別準確率最高，為94.2%；由SPA選出的12個熒光參數參與建模時，LDA識別準確率最高，為94.6%；由IRIV選出的29個熒光參數參與建模時，LDA識別準確率最高，為97.8%；經VISSA選出的25個熒光參數參與建模時，LDA識別準確率最高，為97.8%。僅用3種算法提取的 5個公共參數建模時，準確率最高可達83.7%，仍達到了較高的精度，表明這5個公共參數是與植物干旱脅迫程度高度相關的熒光參數。

表3 不同建模方法下的干旱脅迫識別準確率Table 3 Model accuracy rate under different modeling methods

綜上所述，LDA建立的苗期番茄干旱脅迫識別模型的平均識別準確度最高，SVM次之，KNN效果最差。SPA、IRIV、VISSA所選參數的建模準確度與全參數的建模準確度相當或略高，表明所選參數包含了植物干旱脅迫狀態下的大部分光合作用信息，證明利用 3種參數優選算法提取熒光參數的有效性。

整體識別準確率雖然可以反映模型整體的分類效果，但無法得到不同干旱程度的分類效果，因此，需要通過混淆矩陣來分析具體的分類效果[29]，本研究主要針對分類效果最好的LDA模型下不同參數提取方法對應的結果進行分析，其混淆矩陣如圖5所示。可以得到IRIV-LDA對適宜水分、輕度干旱、中度干旱和重度干旱的識別準確率分別為 100%、95%、98%、98%，較全參數-LDA分別提高了6%、4%、2%和2%，建模效果良好。

3 結 論

以苗期番茄植株為研究對象，利用葉綠素熒光參數完成不同干旱脅迫狀態下植株的干旱等級識別。使用連續投影法（Successive Projections Algorithm，SPA）、迭代保留信息變量法（Iteratively Retains Informative Variables，IRIV）和變量空間迭代收縮法（Variable Iterative Space Shrinkage Approach，VISSA）獲取與干旱脅迫相關的熒光參數，通過線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、支持向量機（Support Vector Machines，SVM）和k 最近鄰（k-Nearest Neighbor，KNN）算法構建識別模型。通過對比分析試驗結果，確定最優干旱脅迫狀態識別模型。主要有以下結論：

1）為降低模型復雜度和冗余度，使用SPA、IRIV、VISSA對獲取的98個葉綠素熒光參數進行參數優選，分別得到12、25、29個熒光參數，并分析3種算法提取的5個公共參數（光適應過程中L2時刻的實際光量子效率、光適應過程中L3時刻的非光化熒光淬滅、基于“Lake”模型的光適應過程中L2時刻的光適應光化學淬滅、基于“Lake”模型的穩態光適應光化學淬滅、基于“Lake”模型的暗弛豫過程中D3時刻的光適應光化學淬滅）的變化趨勢和其所反映的干旱程度對植株光合作用的影響。

2）基于上述熒光參數提取，分別使用LDA、KNN、SVM算法建立干旱脅迫狀態識別模型，試驗結果表明LDA算法建模準確度高于KNN和SVM算法，且參數優選之后的建模準確度與全參數建模準確度相當或有所提高，表明了參數優選方法的有效性。僅用三種算法提取的5個公共參數建模時，準確度最高可達到83.7%，表明這 5個公共參數是與植物干旱脅迫程度高度相關的熒光參數，包含了干旱脅迫下植物光合作用的大部分信息。

3）針對建模效果最好的 LDA模型，對不同熒光參數建模結果的混淆矩陣進行分析。可以得到 IRIV參數優選得到的LDA模型對適宜水分、輕度干旱、中度干旱和重度干旱的識別準確率較全參數分別提高了6%、4%、2%和2%，準確率分別達到了100%、95%、98%、98%。試驗結果表明利用葉綠素熒光動力學參數對苗期番茄干旱脅迫狀態識別是可行的。