擬南芥ABI5亞家族基因表達(dá)特性的比較研究

王新文，王世偉，茍琦敏，王永剛，馬建忠

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050)

2000年，第5個不響應(yīng)ABA的突變體(ABA-insensitive 5)基因abi5被鑒定[1-2]。ABI5基因編碼一堿性亮氨酸拉鏈類(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，它可在花和種胚中表達(dá)，在干種子中積累最多。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，與轉(zhuǎn)錄因子ABI5高度同源的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子共有9個，分別為ABI5/AtDPBF1、AtDPBF2、AtDPBF3/AREB3、AtDPBF4/EEL、ABF1、ABF2/AREB1、ABF3/AtDPBF5、ABF4/AREB2和At5G42910，它們被統(tǒng)稱為ABI5亞家族[3-8]。ABI5亞家族9個成員參與了植物種子的成熟和萌發(fā)、開花時間等生長發(fā)育過程和植物對逆境脅迫的應(yīng)答[9-12]。但由于基因冗余，精細(xì)區(qū)別這9個成員的生理作用或在植物生長發(fā)育過程中扮演的具體角色是一件棘手的工作。如此，確定這9個成員在植物生長發(fā)育過程中的表達(dá)階段和組織以及所響應(yīng)的生理或環(huán)境信號，無疑是理解它們作用和分工的首要工作。

ABI5基因鑒定后，F(xiàn)inkelstein等[1]報道該基因在胚胎發(fā)育的晚期開始表達(dá)，在干種子中其mRNA含量最高。Lopez-Molina等[2]報道，ABI5在花中也有表達(dá)，開花后的長角果長至11 d時可檢測到其mRNA信號。以響應(yīng)ABA的順式元件ABREs(ABA-responsive elements)為誘餌所克隆的ABFs均受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，但強(qiáng)度不同，ABF2最強(qiáng)、ABF4次之、ABF1和ABF3較弱[5]。此外，ABF2、ABF3和ABF4受高鹽誘導(dǎo)，ABF1、ABF2、ABF4受低溫誘導(dǎo)，ABF2和ABF4受干旱誘導(dǎo)[5]。

檢測mRNA含量的方法，不管是Northern blotting或是qRT-PCR，均分析其相對含量。因此，如果不是在同一個平臺上進(jìn)行比較，各基因表達(dá)的強(qiáng)弱就沒有比較意義。Fujita等[13]最早以Northern blotting方法對ABI5家族的9個成員同時進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)無論是ABA處理還是高鹽、干旱處理，ABF2/AREB1的信號都最強(qiáng)；ABF3/AtDPBF5和ABF4/AREB2的表達(dá)強(qiáng)度差不多，二者也均受ABA、高鹽和干旱的誘導(dǎo)；ABF1、ABI5/AtDPBF1和AtDPBF3表達(dá)較弱，似乎也受ABA、高鹽和干旱誘導(dǎo)；AtDPBF2、AtDPBF4/EEL和At5G42910的表達(dá)信號未能檢測到。此后，Yoshida等[14]以qRT-PCR檢測了ABF1、ABF2/AREB1、ABF3/AtDPBF5、ABF4/AREB2和ABI5/AtDPBF1基因表達(dá)的相對強(qiáng)度，卻發(fā)現(xiàn)ABF3/AtDPBF5在無處理和干旱處理的幼苗中表達(dá)最強(qiáng)。這一結(jié)果雖然與此前的報道不太一致，但qRT-PCR檢測在靈敏度上表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。為準(zhǔn)確理解ABI5亞家族9個成員的分工和具體作用，仍然有必要以最為靈敏的分析技術(shù)，在同一平臺上同時對9個基因的表達(dá)特性加以測定和分析，結(jié)果更有比較意義，促進(jìn)理解這9個基因的生物學(xué)功能的異同。本研究采用qRT-PCR方法分析擬南芥ABI5亞家族9個基因在不同組織和生長階段，以及苗期對ABA、高鹽、高滲和低溫等響應(yīng)下mRNA的相對含量變化，以探討9個基因的生物學(xué)功能異同。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型種子為馬建忠實驗室保存。所有種子播種前置于4 ℃冰箱春化3 d。春化后參照王立光等[15]的方法清洗種子，點種于1/2 MS固體培養(yǎng)基表面，于人工氣候培養(yǎng)箱(上海一恒)或營養(yǎng)土中培養(yǎng)，溫度為22 ℃, 相對濕度為55%，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1。

1.2 qRT-PCR檢測

參照RNA提取試劑盒(上海生工，B518661)說明書提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，6210A)合成cDNA, 再以cDNA為模板使用MA-6000熒光定量PCR儀(蘇州雅睿)檢測基因的相對表達(dá)量。qRT-PCR試劑盒購買自TaKaRa(RR037A)。檢測所用特異性引物見表1，其中內(nèi)參基因Actin的上下游引物參照文獻(xiàn)[16]。

表1 qRT-PCR檢測擬南芥ABI5亞家族基因的特異性引物

1.2.1 幼苗期各基因的表達(dá)將1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的剛萌發(fā)的種子(以胚根突破種皮出現(xiàn)白色胚根為準(zhǔn)，記為1 d齡幼苗)提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR，檢測基因的相對表達(dá)量；分別取萌發(fā)后5 d齡、9 d齡和13 d齡擬南芥整株幼苗的總RNA，進(jìn)行萌發(fā)后生長階段ABI5亞家族各成員的qRT-PCR實驗，檢測各基因動態(tài)表達(dá)。

1.2.2 擬南芥幼苗期不同脅迫下基因的表達(dá)將1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d齡的幼苗，移到含不同濃度的蔗糖、NaCl、山梨醇(三者使用的濃度梯度均為50、100 和200 mmol·L-1)和ABA(10、25和50 μmol·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d，檢測不同脅迫對擬南芥萌發(fā)后生長的影響；13 d齡的幼苗分別在不同脅迫下(20 μmol·L-1ABA、100 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1山梨醇和4 ℃)處理0、0.5、1、2、4 和6 h后提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR實驗。于營養(yǎng)土培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)60 d齡的擬南芥植株。

1.2.3 擬南芥不同組織部位各基因的表達(dá)營養(yǎng)土培養(yǎng)60 d的擬南芥植株，分別選取足夠量的根、莖、葉、花、果莢及成熟種子等組織，提取總RNA，進(jìn)行qRT-PCR，檢測各基因在不同部位的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABI5亞家族基因在擬南芥苗期的表達(dá)動態(tài)和mRNA的相對含量

在適宜的生長條件下，擬南芥的生活周期約7～8周，分為兩個明顯的生長發(fā)育階段：營養(yǎng)生長期與生殖生長期。營養(yǎng)生長不僅是一個植物長大的過程，也是植物從營養(yǎng)生長往生殖生長轉(zhuǎn)折的積蓄過程。因此，本研究首先對營養(yǎng)生長階段ABI5亞家族基因表達(dá)的動態(tài)進(jìn)行了測定。在營養(yǎng)生長階段，除At5G42910的信號檢測不到外，ABF1和ABF2基因的表達(dá)隨生長天數(shù)的增加而逐漸上升，而ABF3、ABF4、ABI5、AtDPBF2、AtDPBF3、AtDPBF4在種子剛萌發(fā)時表達(dá)量最高，與5 d齡的幼苗相比，分別升高了約51倍、37倍、520倍、820倍、44倍和193倍；隨后在5 d齡幼苗中表達(dá)量均降至最低，之后又分別隨著生長天數(shù)的增加而增加(圖1，A)。At5G42910基因的信號在1 d齡、5 d齡、9 d齡和13 d齡的幼苗中始終未檢測到。

除GUS組織化學(xué)染色分析外，對ABI5亞家族基因在擬南芥幼苗階段表達(dá)動態(tài)的相對定量尚未見其他報道。從本研究結(jié)果看，AtDPBF2和AtDPBF4基因在幼苗生長階段相對表達(dá)量均大幅增加。尤其是AtDPBF4，在9 d齡的幼苗中，其相對表達(dá)量已大幅增加。據(jù)此，AtDPBF2和AtDPBF4基因可能在擬南芥生長發(fā)育的轉(zhuǎn)型中發(fā)揮了更多作用。

ABI5亞家族中除ABI5外，其余7個基因在幼苗生長的不同階段的相對表達(dá)量呈逐漸走高模式。其中，AtDPBF2和AtDPBF4的表達(dá)增強(qiáng)尤其顯著。對該亞家族的9個基因相互間比較，分析擬南芥幼苗生長早期它們的mRNA相對含量。以13 d齡擬南芥幼苗中ABI5的mRNA含量為1，經(jīng)qRT-PCR分析表明，ABI5亞家族各成員的mRNA相對含量存在著明顯的差異。ABF3的相對含量最高，約為ABI5的59倍；ABF2、ABF4和AtDPBF3次之，分別約為ABI5的32倍、30倍和14倍；ABF1和AtDPBF4分別約為ABI5的4倍和2倍；而AtDPBF2表達(dá)量最少，約為ABI5的0.1倍(圖1，B)。At5G42910的信號仍然檢測不到。ABI5亞家族基因在擬南芥幼苗中的mRNA相對含量與Fujita等[13]以Northern blotting分析的結(jié)果基本一致，即ABF3、ABF2、ABF4和AtDPBF3的相對含量較高。在Fujita等[13]的結(jié)果中，Northern blotting最強(qiáng)的信號是ABF2而不是ABF3，似乎和本研究結(jié)果不太一致。但仔細(xì)觀察他們的Northern blotting分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ABF3呈現(xiàn)出了2條雜交帶。由于ABF3和AtDPBF5是一個編碼基因的2個不同的剪切本[7]，二者的mRNA長度不同，Northern Blotting可檢出2條雜交帶，而qRT-PCR則把二者的信號可能加和在了一起，以致在本實驗中ABF3呈現(xiàn)出了最高的mRNA相對含量。

A. ABI5亞家族成員在不同天齡擬南芥幼苗中的相對表達(dá)量(以5 d齡中各基因的表達(dá)為對照)。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(Student’s t-test)；B. 13 d齡擬南芥幼苗中ABI5亞家族成員mRNA的相對含量(ABI5的mRNA含量計為1)。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 ABI5亞家族基因在幼苗生長階段的表達(dá)A. Relative expression levels of the ABI5 subfamily genes in different-day-old seedlings of Arabidopsis. * indicates significant difference at P<0.05 and ** indicates significant difference at P<0.01 (Student’s t-test); B. Relative mRNA contents of ABI5 subfamily members in 13-day-old Arabidopsis seedlings. Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)Fig.1 Expression of ABI5 subfamily genes in the growth stage of Arabidopsis seedlings

2.2 擬南芥不同組織部位中ABI5亞家族各基因的表達(dá)

擬南芥在培養(yǎng)4周左右時開始從營養(yǎng)生長階段向生殖生長期轉(zhuǎn)變。本研究接著對生殖生長階段ABI5亞家族9個基因在根、莖、葉片、花、果莢和成熟種子中的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行了測定。本研究發(fā)現(xiàn)(圖2)，在60 d齡植株中該家族基因在花和成熟種子中大量表達(dá)。與根中的表達(dá)量相比，除ABF3和At5G42910以外的其他7個基因均在種子中大量表達(dá)，且ABI5的表達(dá)量最高，上升730倍，ABF1、ABF2、ABF4、AtDPBF2、AtDPBF3 和AtDPBF4分別上升了約3倍、10倍、24倍、31倍、17倍和101倍；在花中，ABI5的表達(dá)量最高，上升了122倍，ABF1的表達(dá)量最低，ABF4和AtDPBF3上升了8倍，其他5個基因的表達(dá)均約增加了3倍。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在葉片中ABFs基因大量表達(dá)，且ABF2表達(dá)量最高，增加了10倍，而DPBFs(包括ABI5)少量表達(dá)；在果莢中，AtDPBF2表達(dá)量最高，上升了約12倍，ABF2、ABI5 和At5G42910均增加了約5倍；在莖和根中9個基因均少量表達(dá)。

圖2 ABI5亞家族基因在不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of ABI5 subfamily genes in the different tissues of Arabidopsis

2.3 不同脅迫處理對擬南芥幼苗生長的影響

ABI5亞家族基因參與了ABA、干旱、高滲和低溫等信號途徑[5, 17]。不同脅迫對擬南芥種子萌發(fā)的影響不同。圖3顯示，擬南芥種子萌發(fā)4 d后，將幼苗移到含不同濃度的蔗糖、NaCl、山梨醇和ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，8 d后幼苗長勢出現(xiàn)了明顯差異。其中，不同濃度蔗糖處理對幼苗地上部分影響不顯著，對根的生長隨蔗糖濃度升高出現(xiàn)了明顯的抑制；不同濃度NaCl處理抑制擬南芥幼苗的生長，200 mmol·L-1NaCl對幼苗幾乎致死；不同濃度山梨醇處理同樣抑制幼苗根部生長，地上部分葉片萎縮；不同濃度ABA處理下擬南芥幼苗生長發(fā)育整體減緩，10 μmol·L-1的抑制效應(yīng)已非常明顯，隨著濃度上升抑制效應(yīng)加劇(圖3)。

圖3 不同濃度外源物質(zhì)處理對擬南芥幼苗生長的影響Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous substances on the growth of Arabidopsis seedlings

2.4 不同脅迫處理對ABI5亞家族基因表達(dá)的影響

ABI5亞家族成員參與了植物對ABA、干旱、低溫、高滲等響應(yīng)的信號途徑[5, 13, 17-18]。據(jù)此測定ABI5亞家族成員基因在ABA、山梨醇、NaCl、低溫等因素處理的13 d齡幼苗中的表達(dá)狀況。

20 μmol·L-1ABA處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h，ABF1、ABF2、ABF3、ABF4和ABI5的mRNA相對含量逐漸升高，其中ABF1和ABI5的增加最為顯著，二者均接近30倍的增幅；AtDPBF2基因的mRNA相對含量呈低-高-低走勢；AtDPBF3、AtDPBF4基因的表達(dá)對ABA沒有明顯的響應(yīng)(圖4，A)。

圖4 不同脅迫處理及其時間對擬南芥苗期ABI5亞家族各基因mRNA含量變化的影響Fig.4 Change on the relative mRNA contents of the ABI5 subfamily genes in the seedlings of Arabidopsis during different stresses

100 mmol·L-1山梨醇處理13 d齡擬南芥幼苗0.5～6 h，ABF1、ABF4和ABI5的mRNA相對含量隨著時間的增加而明顯升高，ABF1的mRNA相對含量上升最高，接近120倍；ABF3和AtDPBF2的mRNA相對含量先上升，隨后有所下降；ABF4和AtDPBF4的mRNA相對含量略有上升；ABF2基因的mRNA相對含量變化不明顯，而AtDPBF3的表達(dá)略有下降(圖4，B)。

高鹽(100 mmol·L-1NaCl)處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h時，ABI5亞家族成員基因的表達(dá)狀況比較復(fù)雜。ABF3基因的mRNA相對含量發(fā)生了顯著上升，其余成員基因的mRNA相對含量要么變化不顯著(如ABF1、ABF2、AtDPBF2和AtDPBF3基因)、要么略有下降(如ABF4、ABI5和AtDPBF4基因)(圖4，C)。

4 ℃低溫處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h時，ABF1和ABI5基因的mRNA相對含量大幅上升，ABF1基因的相對表達(dá)量上升了約110倍，ABI5基因也上升了約25倍；ABF3、ABF4、AtDPBF2和AtDPBF4基因的mRNA相對含量略有上升；ABF2和AtDPBF3基因的表達(dá)變化則不明顯(圖4，D)。低溫誘導(dǎo)ABF1基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，這一結(jié)果與Choi等的結(jié)果一致[5]。

3 討 論

在植物的生長發(fā)育過程中，不同基因在不同時期的有序表達(dá)調(diào)控著植物的形態(tài)建成和生長期轉(zhuǎn)變。擬南芥ABI5亞家族的9個基因參與調(diào)控擬南芥種子的成熟、萌發(fā)、開花時間，以及對ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫的響應(yīng)[9-12, 19-22]。理解ABI5亞家族這9個基因在擬南芥生長發(fā)育過程中的分工和具體作用，確定它們時空表達(dá)次序和響應(yīng)因素非常重要。自ABI5亞家族基因先后被克隆、鑒定以來，只有Fujita等[13]以Northern blotting對這9個成員基因同時進(jìn)行了比較。但遺憾的是有3個基因(AtDPBF2、AtDPBF4和At5G42910)完全沒有信號，ABF1、ABI5和AtDPBF3也因信號較弱難以做出準(zhǔn)確判斷。本研究以qRT-PCR同時分析了ABI5亞家族9個基因在擬南芥不同生長發(fā)育時期、不同組織部位和脅迫處理下的表達(dá)情況。在種子剛萌發(fā)時除ABF1和ABF2以外的7個基因均大量表達(dá)，這可能是因為種子在打破休眠開始生長前，種子為維持休眠而大量表達(dá)，而在剛萌發(fā)時這種調(diào)控表達(dá)未完全解除。與之對應(yīng)的在成熟種子中9個基因均大量表達(dá)，這也從側(cè)面說明ABF1和ABF2可能在調(diào)控種子萌發(fā)方面起著重要作用。在營養(yǎng)生長階段，從5 d齡起ABI5亞家族9個基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在生殖生長階段，ABFs側(cè)重在葉片中表達(dá)，AtDPBFs側(cè)重在種子和花中表達(dá)，且在種子中9個基因均大量表達(dá)，這與它們在擬南芥的開花、種子發(fā)育等后期生長發(fā)育階段發(fā)揮作用相對應(yīng)。

此后，Yoshida等[14]以qRT-PCR分析了ABA、干旱和高鹽對ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2和ABI5等5個基因的mRNA相對含量的影響。ABI5亞家族成員基因中，4個ABFs基因均受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，而4個AtDPBFs基因中僅ABI5/AtDPBF1受ABA的顯著誘導(dǎo)，這可能與ABFs是以結(jié)合ABA的順式元件為誘餌所克隆、而AtDPBFs是以體細(xì)胞胚中特異表達(dá)的順式元件為誘餌所克隆有關(guān)[3-5]。Choi等[5]以Northern blotting分析ABFs對ABA的響應(yīng)，認(rèn)為ABF2和ABF4受ABA誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)，而本結(jié)果中卻是ABF1和ABI5的表達(dá)增強(qiáng)最為顯著，造成這種差異的原因可能在于這些基因在擬南芥中的相對含量差異巨大，ABF2和ABF4基因的表達(dá)強(qiáng)度在無處理的擬南芥幼苗中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ABF1和ABI5，它們在ABA誘導(dǎo)時增加幅度不大，只是因為它們在ABA處理前的幼苗中含量已經(jīng)相當(dāng)高。

此外，Choi等[5]發(fā)現(xiàn)低溫處理下只有ABF1有明顯的表達(dá)；NaCl處理下ABF2和ABF3強(qiáng)烈表達(dá)，ABF1有微弱的表達(dá)；低溫、干旱及NaCl等3種處理均誘導(dǎo)了ABF4的表達(dá)[5]。本結(jié)果表明低溫不僅誘導(dǎo)ABF1強(qiáng)烈表達(dá)，也誘導(dǎo)ABI5基因的顯著表達(dá)；NaCl處理下只有ABF3表達(dá)有顯著增強(qiáng)。這些差異是由于這9個基因在無處理的擬南芥幼苗中起始含量之間存在巨大差異所造成。

到目前為止，雖然以RT-PCR可以從擬南芥幼苗中擴(kuò)增到At5G42910基因的轉(zhuǎn)錄本，但以Northern blotting或qRT-PCR均難檢測到At5G42910基因表達(dá)的信號，以致Fujita等[13]推測其可能是個假基因。本研究發(fā)現(xiàn)幼苗中雖然At5G42910基因的表達(dá)信號難以檢測，但其在花和果莢中大量表達(dá)，推測該基因在種子形成及成熟過程中起著重要作用。