Ceritinib增強ABCB1過表達白血病多藥耐藥的作用及機制研究

鐘健生 張金麗 張星 于曉陽 佃林萍

白血病是一種造血干細胞出現病變的惡性腫瘤,兒童和青少年人群多見［1］。臨床治療常以放療、化療、免疫治療、靶向治療以及骨髓移植等為主,預后和生存率均有了很大提升,但是仍有患者產生多藥耐藥性［2］。而腺苷三磷酸(ATP)結合盒式蛋白(ABC) 超家族在多藥耐藥的形成過程當中扮演著重要的角色,如ABCB1,是位于第7號染色體上由ABCB1基因所編碼的糖蛋白。研究證實,ABCB1在耐藥白血病細胞中存在過表達。Ceritinib是美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于治療非小細胞肺癌的選擇性第二代間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑［3］。研究提示［4］,Ceritinib對多藥耐藥ABCB1表達的實體腫瘤細胞體內體外都有很好的逆轉耐藥活性。本研究擬通過動物實驗、細胞株及體外實驗觀察Ceritinib是否增強ABCB1過表達白血病細胞化療藥物的療效,現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 主要材料包括阿霉素、紫杉醇、順鉑、維拉帕米、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma company)；Ceritinib(美國Selleck Chemical公司)；細胞株：K562/adr細胞,K562細胞；北京維通利華公司培養5～6周齡的BALA/c-nu雌性裸鼠；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)、酶標儀(Model 550)(美國Bio-Rad公司)、Forma 3Ⅲ CO2水套培養箱(美國Thermo公司)等。

1.2方法

1.2.1四甲基偶氮唑藍(MTT法)檢測細胞毒性 不同濃度化療藥物加或不加Ceritinib、維拉帕米。5%CO237℃孵育細胞68 h,每孔加入MTT,4 h后離心,移除培養基,加入DMSO。酶標儀檢測光密度540 nm,底物670 nm。計算底物IC50值和多藥耐藥逆轉倍數。重復3次。

1.2.2體內實驗 收集約1×107K562/adr細胞,皮下植入至5～6周裸鼠腋下。腫瘤直徑達0.5 cm時隨機分四組處理：生理鹽水組(4 ml每2天1次灌胃,12 d)；Ceritinib組(25 mg/kg,每2天1次灌胃,共12 d)；阿霉素組(2 mg/kg,每2 天1次腹腔注射,共12 d)；Ceritinib聯合阿霉素組(注射阿霉素前1 h給予Certinib灌胃,25 mg/kg,每2天1次；阿霉素2 mg/kg,每2天1次腹腔注射,共12 d)。每2天檢測小鼠體重和腫瘤正交直徑,繪制腫瘤生長曲線,計算生長抑制率。

1.3觀察指標 分析Ceritinib對增強傳統化療藥物的作用；比較四組腫瘤體積和腫瘤平均重量。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 ()表示,采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1Ceritinib對增強傳統化療藥物的作用分析Ceritinib能夠濃度依賴性降低 K562/adr 細胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其對細胞的毒性作用,但是Ceritinib卻未能改變順鉑(不是ABCB1底物的)的細胞毒性。見表1。

表1 Ceritinib對增強傳統化療藥物的作用分析()

表1 Ceritinib對增強傳統化療藥物的作用分析()

2.2四組腫瘤體積和腫瘤平均重量的比較 生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義(P>0.05)；Ceritinib聯合阿霉素組的腫瘤體積小于生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組,差異有統計學意義(P<0.05)；Ceritinib聯合阿霉素組腫瘤平均重量低于生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組,差異有統計學意義(P <0.05)。見圖1,表2。

表2 四組腫瘤平均重量比較(,g)

表2 四組腫瘤平均重量比較(,g)

注：與生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組比較,aP<0.05

圖1 四組腫瘤體積比較

3 討論

白血病是目前發病機制尚不明確的惡性血液腫瘤,病程上主要分為急性和慢性兩類［5］。治療過程中產生的多藥耐藥是導致白血病治療失敗和復發的主要因素。多藥耐藥是指在通過一種抗腫瘤藥物治療后不僅出現了對該藥的抵抗性,而且會對其他具有相似結構或相似靶點的藥物也同時產生抵抗［6］。及時有效的發現腫瘤耐藥的主要原因和機制,并找到更加有效的治療辦法或者克服耐藥成為目前白血病治療的關鍵。

Ceritinib是一種小分子酪氨酸激酶的選擇性第二代ALK抑制劑,可以通過與抗癌藥物競爭 ABCB1的底物結合位點,抑制ABCB1轉運蛋白的外排活性,表明Ceritinib在表達ABCB1過表達的多藥耐藥實體腫瘤細胞中具有強效的逆轉活性［7］。其作用機制是通過抑制ALK和ALK介導的下游信號蛋白的磷酸化,間接抑制ALK陽性癌細胞的增殖［8］。本研究結果顯示,Ceritinib能夠濃度依賴性地降低 K562/adr 細胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其對細胞的毒性作用,但是Ceritinib卻未能改變順鉑(不是ABCB1底物的)的細胞毒性。生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義(P>0.05)；Ceritinib聯合阿霉素組的腫瘤體積小于生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組,差異有統計學意義(P<0.05)；Ceritinib聯合阿霉素組腫瘤平均重量低于生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組,差異有統計學意義(P<0.05)。國內研究［9］提示,Ceritinib能夠在85%以上的細胞存活濃度下增強抗腫瘤藥物的療效,逆轉ABCB1轉運蛋白所介導的多藥耐藥,與本研究結果一致。

綜上所述,Ceritinib可以增強ABCB1過表達白血病細胞化療藥物的療效,為新型多藥耐藥調節劑的開發提供策略。