Ceritinib增強(qiáng)ABCB1過表達(dá)白血病多藥耐藥的作用及機(jī)制研究

鐘健生 張金麗 張星 于曉陽 佃林萍

白血病是一種造血干細(xì)胞出現(xiàn)病變的惡性腫瘤,兒童和青少年人群多見［1］。臨床治療常以放療、化療、免疫治療、靶向治療以及骨髓移植等為主,預(yù)后和生存率均有了很大提升,但是仍有患者產(chǎn)生多藥耐藥性［2］。而腺苷三磷酸(ATP)結(jié)合盒式蛋白(ABC) 超家族在多藥耐藥的形成過程當(dāng)中扮演著重要的角色,如ABCB1,是位于第7號(hào)染色體上由ABCB1基因所編碼的糖蛋白。研究證實(shí),ABCB1在耐藥白血病細(xì)胞中存在過表達(dá)。Ceritinib是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌的選擇性第二代間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑［3］。研究提示［4］,Ceritinib對(duì)多藥耐藥ABCB1表達(dá)的實(shí)體腫瘤細(xì)胞體內(nèi)體外都有很好的逆轉(zhuǎn)耐藥活性。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞株及體外實(shí)驗(yàn)觀察Ceritinib是否增強(qiáng)ABCB1過表達(dá)白血病細(xì)胞化療藥物的療效,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 主要材料包括阿霉素、紫杉醇、順鉑、維拉帕米、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma company)；Ceritinib(美國(guó)Selleck Chemical公司)；細(xì)胞株：K562/adr細(xì)胞,K562細(xì)胞；北京維通利華公司培養(yǎng)5～6周齡的BALA/c-nu雌性裸鼠；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)、酶標(biāo)儀(Model 550)(美國(guó)Bio-Rad公司)、Forma 3Ⅲ CO2水套培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)等。

1.2方法

1.2.1四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞毒性 不同濃度化療藥物加或不加Ceritinib、維拉帕米。5%CO237℃孵育細(xì)胞68 h,每孔加入MTT,4 h后離心,移除培養(yǎng)基,加入DMSO。酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度540 nm,底物670 nm。計(jì)算底物IC50值和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。重復(fù)3次。

1.2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 收集約1×107K562/adr細(xì)胞,皮下植入至5～6周裸鼠腋下。腫瘤直徑達(dá)0.5 cm時(shí)隨機(jī)分四組處理：生理鹽水組(4 ml每2天1次灌胃,12 d)；Ceritinib組(25 mg/kg,每2天1次灌胃,共12 d)；阿霉素組(2 mg/kg,每2 天1次腹腔注射,共12 d)；Ceritinib聯(lián)合阿霉素組(注射阿霉素前1 h給予Certinib灌胃,25 mg/kg,每2天1次；阿霉素2 mg/kg,每2天1次腹腔注射,共12 d)。每2天檢測(cè)小鼠體重和腫瘤正交直徑,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

1.3觀察指標(biāo) 分析Ceritinib對(duì)增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的作用；比較四組腫瘤體積和腫瘤平均重量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Ceritinib對(duì)增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的作用分析Ceritinib能夠濃度依賴性降低 K562/adr 細(xì)胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其對(duì)細(xì)胞的毒性作用,但是Ceritinib卻未能改變順鉑(不是ABCB1底物的)的細(xì)胞毒性。見表1。

表1 Ceritinib對(duì)增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的作用分析()

表1 Ceritinib對(duì)增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的作用分析()

2.2四組腫瘤體積和腫瘤平均重量的比較 生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ceritinib聯(lián)合阿霉素組的腫瘤體積小于生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ceritinib聯(lián)合阿霉素組腫瘤平均重量低于生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見圖1,表2。

表2 四組腫瘤平均重量比較(,g)

表2 四組腫瘤平均重量比較(,g)

注：與生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組比較,aP<0.05

圖1 四組腫瘤體積比較

3 討論

白血病是目前發(fā)病機(jī)制尚不明確的惡性血液腫瘤,病程上主要分為急性和慢性兩類［5］。治療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥是導(dǎo)致白血病治療失敗和復(fù)發(fā)的主要因素。多藥耐藥是指在通過一種抗腫瘤藥物治療后不僅出現(xiàn)了對(duì)該藥的抵抗性,而且會(huì)對(duì)其他具有相似結(jié)構(gòu)或相似靶點(diǎn)的藥物也同時(shí)產(chǎn)生抵抗［6］。及時(shí)有效的發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥的主要原因和機(jī)制,并找到更加有效的治療辦法或者克服耐藥成為目前白血病治療的關(guān)鍵。

Ceritinib是一種小分子酪氨酸激酶的選擇性第二代ALK抑制劑,可以通過與抗癌藥物競(jìng)爭(zhēng) ABCB1的底物結(jié)合位點(diǎn),抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排活性,表明Ceritinib在表達(dá)ABCB1過表達(dá)的多藥耐藥實(shí)體腫瘤細(xì)胞中具有強(qiáng)效的逆轉(zhuǎn)活性［7］。其作用機(jī)制是通過抑制ALK和ALK介導(dǎo)的下游信號(hào)蛋白的磷酸化,間接抑制ALK陽性癌細(xì)胞的增殖［8］。本研究結(jié)果顯示,Ceritinib能夠濃度依賴性地降低 K562/adr 細(xì)胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其對(duì)細(xì)胞的毒性作用,但是Ceritinib卻未能改變順鉑(不是ABCB1底物的)的細(xì)胞毒性。生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ceritinib聯(lián)合阿霉素組的腫瘤體積小于生理鹽水組、Ceritinib組、阿霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ceritinib聯(lián)合阿霉素組腫瘤平均重量低于生理鹽水組、Ceritinib組和阿霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。國(guó)內(nèi)研究［9］提示,Ceritinib能夠在85%以上的細(xì)胞存活濃度下增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效,逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的多藥耐藥,與本研究結(jié)果一致。

綜上所述,Ceritinib可以增強(qiáng)ABCB1過表達(dá)白血病細(xì)胞化療藥物的療效,為新型多藥耐藥調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供策略。