BMP2與BMP4的基因多態(tài)性與難治性根尖周炎風(fēng)險的相關(guān)性

熱孜亞·艾尼 馬依熱·阿布都賽麥提 陳曉濤

根尖周持續(xù)感染(persistent apical peridodontitis，PAP)作為慢性根尖周炎的一種臨床表現(xiàn)形式，雖然微生物的存在是PAP 發(fā)生的始動因子[1,2]，但在過去研究中，已經(jīng)表明遺傳多態(tài)性與炎癥和細胞活化相關(guān)分子的表達差異有關(guān)，故基因影響可有助于解釋多種疾病的易感[3,4]。且既往研究中證實[5,6]，RANKL、RANK、MMP1、MMP3 等基因的遺傳多態(tài)性可影響RAP的進展和治療反應(yīng)。微生物代謝產(chǎn)物及其相關(guān)毒力因子誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，造成骨細胞與破骨細胞動態(tài)平衡紊亂，影響RANKL、RANK、MMP1的等基因表達，不利于骨吸收和再生修復(fù)?？紤]到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4 可通過對破骨細胞相關(guān)因子的產(chǎn)生或強化作用而抑制破骨細胞分化過程，故本研究對BMP4 基因rs17563 位點、BMP2 基因rs1005464 和rs235768 位點基因型多態(tài)性與RAP的相關(guān)性進行探討，現(xiàn)報道如下。

1.資料及方法

1.1 一般資料 選取我院2018 年6 月至2020年8 月期間62 例根尖性牙周炎病變治療失敗需行顯微根尖外科手術(shù)治療的患者作為RAP組，RAP納入標準：(1)符合《牙體牙髓病學(xué)》中[7]關(guān)于RAP診斷標準；(2)患牙有根管治療史；(3)有竇道或竇道治療后未消失；(4)上前牙X 線片顯示根尖暗影最大直徑超過10mm。排除標準：(1)近期使用過全身抗生素治療者；(2)合并全身性疾病不耐受手術(shù)者；(3)存在根管側(cè)穿；(4)重度牙周病、牙根出現(xiàn)縱折。選取同期根尖性牙周炎病變治療后根部充實且根尖周圍健康的98 例作為對照組。醫(yī)院倫理委員會已批準本研究，患者及家屬簽署同意書。兩組一般資料(性別、年齡、是否吸煙等)對比P＞0.05，見表1。

表1 兩組一般資料比較(，n%)

1.2 方法

1.2.1 標本采集 收集所有試驗患者血液標本，采取1.5ml 靜脈血，加EDTA 二鈉抗凝，提取白細胞基因組DNA(以改良碘化鈉法)，其余置于醫(yī)用冰箱(-80℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性位點檢測(1)引物：由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成根據(jù)BMP4 基因(rs17563)、BMP2 基因(rs1005464、rs235768)的多態(tài)性設(shè)計序列特異性引物，所用引物詳見表2。(2)實時聚合酶鏈反應(yīng)條件：所有基因PCR 反應(yīng)體系體積20μL，DNA 模板量1μg，上、下游引物濃度均為1poml，10μL2×PCR 緩沖液，0.5μl dNTP，耐熱DNA 聚合酶和雙蒸水分別為0.5μl、18.5μl。(3)循環(huán)條件：①BMP4(rs17563 位點)：預(yù)變性2 min94℃，25 個循環(huán)，三步法(94℃、55℃、72℃分別為20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min，25℃反應(yīng)終止；②BMP2(rs1005464 和rs235768 位點)：預(yù)變性90s94℃，25 個循環(huán)，三步法(94℃、55℃、72℃分別為20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min；(4)PCR 產(chǎn)物電泳：于瓊脂糖凝膠(2%)將4μL 反應(yīng)產(chǎn)物上樣，選擇適當(dāng)恒壓，在緩沖液中以80V，20min 進行電泳，并對BMP4、BMP2 基因位點的基因型及等位基因頻率進行判讀。

1.3 觀察指標 比較兩組BMP4、BMP2 基因位點基因型及等位基因頻率，并采用邏輯回歸其與RAP 發(fā)生的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用(n%)表示，采用χ2檢驗；計量資料以()表示，采用獨立樣本t 檢驗；采用Logistic 進行相關(guān)性分析，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較 RAP 組rs235768 TT基因型頻率、rs235768 等位基因頻率中TT 高于對照組(P＜0.05)，兩組rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(P＞0.05)，見表3、表4。

表3 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(n%)

表4 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(n%)

2.2 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?RAP 組C 基因型74.19%及頻率66.13%較對照組48.98%、37.24%高(P＜0.05)，見表5。

表5 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?n%)

2.3 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C 基因型頻率顯著高于對照組(P＜0.05)，且C 等位基因頻率顯著高于對照組(P＜0.05)，見表6。

表6 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?n%)

2.4 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性與RAP的相關(guān)性分析 BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)和BMP4基因rs17563 位點CT 基因型及TT 基因型(OR=0.319，95%CI0.132～0.769；OR=0.196，95%CI0.087～0.444)分別是RAP 發(fā)生的保護因素和危險因素，見表7。

表7 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性與RAP的相關(guān)性分析

3.討論

根管治療聯(lián)合顯微根尖外科手術(shù)是治療RAP的有效手段，但手術(shù)療效受牙齦切除，去骨，機體免疫，牙齒本身條件等因素限制，故探求RAP病因，根據(jù)病因選擇合理的治療方案十分必要。RAP 表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性根尖周膿腫和進行性骨質(zhì)破壞，可導(dǎo)致牙槽骨缺損和牙齒喪失，是以淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等組成的炎性浸潤為主要特征，這些細胞可通過釋放促炎細胞因子來協(xié)助骨修復(fù)過程[8-9]。而骨修復(fù)通常由防御機制和病原體之間和/ 或牙髓治療后的自發(fā)平衡啟動，且涉及多個因素參與。BMP 為參與該過程的重要因子，從氨基酸序列上看，BMP 隸屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族，BMP2、BMP4 為BMP 中誘導(dǎo)成骨活性最強的因子，可促進牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生，由于BMP2、BMP4 在骨生物學(xué)中具有重要作用[10]，其可能參與RAP發(fā)生，故探討B(tài)MP2與BMP4的基因多態(tài)性與RAP 風(fēng)險的相關(guān)性可為該疾病的治療提供一定理論依據(jù)。

BMP2 基因定位于20p12，屬于疏水性蛋白，主要由前體蛋白、信號肽和成熟結(jié)構(gòu)域組成，參與成骨性細胞分化、基質(zhì)合成與分泌。BMP2 作為影響骨組織形成的局部生長因子，可在骨形成早期，能募集未分化間質(zhì)細胞，向骨系細胞分化；還可通過增強成骨細胞內(nèi)的下游信號分子Smadl/ 5 和表基因Runx2的表達促使骨形成。Kang[11]、Jian[12]將含有rhBMP-2 基因的噬菌體轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細胞，在牙周膜干細胞的成骨細胞分化過程中，BMP2 具有一定調(diào)節(jié)作用。在骨吸收過程中，BMP2可能通過RANK、OPG 等系統(tǒng)干擾破骨細胞前體分化；Malik[13]表明Bmp2 在成牙本質(zhì)細胞組織中的作用，可為定向和組織化的牙齒礦化提供充足時間。本研究中，RAP 組TT 基因型45.16%、T 等位基因頻率63.71%均較對照組21.43%、57.14%高，Logistic 分析顯示，BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)是RAP危險因素，提示BMP2 基因rs235768C/ T多態(tài)性可能為RAP 發(fā)生的危險因素。BMP2 基因rs235768 位點攜帶T 等位基因會影響牙槽骨的吸收，這在既往已研究中得到證實[14]；Mitra 指出BMP2 rs235768 A＞T 可影響頜面、牙胚發(fā)育[15]；Dds ECK[16]等證實攜帶rs235768(BMP2)TT 基因型(雙絲氨酸突變體)持續(xù)性根尖周炎者患巴氏桿菌的風(fēng)險是CC 基因型4 倍以上。這也在一定程度上說明BMP2 基因rs235768 多態(tài)性極大地增加RAP發(fā)生風(fēng)險。

BMP4與BMP2 同屬于BMP 家族，與BMP2不同的是該基因定位于染色體14q22-q23，可通過對細胞增殖、分化等過程進行調(diào)節(jié)以控制成骨、破骨細胞，促進骨發(fā)育，且參與上頜突發(fā)育成上唇和繼發(fā)腭的過程。Bahrami 等[17]指出，BMP4 rs17563多態(tài)性可能是中國人和巴西人發(fā)展NSCLP的危險因素；Hao[18]的研究中rsl7563 位點CC 基因型是TT 基因型發(fā)生唇腭裂危險的1.612 倍，提示rsl7563 位點CC 基因型可能會影響口腔頜面部的發(fā)育。本研究多因素分析顯示，CT、TT 基因型是RAP 發(fā)生的保護因素(OR=0.319、OR=0.196)。出現(xiàn)這一結(jié)果可能與在高炎癥水平環(huán)境下，可抑制BMP4、Smad1/ 5 磷酸化水平，在一定程度上對牙髓干細胞的成牙/ 成骨分化能力造成影響[19,20]。而rs17563 是惟一位于編碼區(qū)域的SNP 位點，該位點普遍存在的高頻堿基轉(zhuǎn)換，可引起編碼蛋白纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，而兩者均為疏水氨基酸，纈氨酸的異丙基結(jié)構(gòu)較丙氨酸甲基大，多集中在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，T→C 錯義突變則會引起活性部位的結(jié)構(gòu)改變，進而使蛋白質(zhì)活性喪失，降低BMP4 水平表達，進而增加RAP 發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。

綜上所述，BMP2 和BMP4的基因多態(tài)性可參與RAP的發(fā)生，BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型是RAP發(fā)生的危險因素，BMP4 基因rs17563 位點CT 基因型及TT 基因型是RAP 發(fā)生的保護因素。本研究不足之處在于選定基因的SNPs 數(shù)量有限，其具體影響機制尚需進一步研究，且樣本選取較為局限，今后可將選取不同地區(qū)、不同族群進一步驗證。