ICP-MS結合化學計量學分析不同來源陳皮中38個無機元素△

彭政，郭秀芝，周利，吳統(tǒng)選，王升，康傳志，萬修福，郭蘭萍，張燕*，楊健*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；

2.中國中醫(yī)科學院 健康研究院，江西 南昌 330000；

3.天圣制藥集團股份有限公司，重慶 401120

無機元素是植物中普遍存在的一類成分，其種類及含量不僅是植物遺傳特征的體現(xiàn)，也與不同栽培地區(qū)的環(huán)境因素和種植條件等有很大的關聯(lián)[1]。同樣，無機元素對中藥的生長及其在人體內的消化吸收、藥理作用的發(fā)揮有密切的關系。如Zn 元素可能與當歸、紅花、艾葉的活血、補血和止血功能有一定的聯(lián)系[2]；Mg 元素對重樓中的酶有激活作用[3]。對甘草中的無機元素進行研究發(fā)現(xiàn)，其有效成分甘草酸和甘草苷的含量與無機元素密切相關，種植甘草時可以通過調控微量元素施用種類和濃度，達到調控藥材有效成分的目的[4]。

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為“廣陳皮”和“陳皮”，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[5]，用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多。陳皮作為藥食兩用的中藥材，其元素含量必須在規(guī)定的藥品和食品中重金屬限度標準內[6]。研究發(fā)現(xiàn)，陳皮中含有多種無機元素，加工制品陳皮中的Zn、Fe元素較鮮陳皮中的高，而Ca、K、Fe、Mg、Zn元素比陳皮果肉中的含量高[7-9]。

中藥材中無機元素測定方法包括原子吸收光譜法（AAS）、原子發(fā)射光譜法（AES）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）等。傳統(tǒng)的元素檢測方法如石墨爐AAS 雖然準確度較高，但只能單次進樣并且測定的元素種類有限，耗時且成本較高。AES 可以同時測定多種元素，但其靈敏度低的缺點使其不能分析某些痕量元素，可以用于元素含量的分析但不能進行元素形態(tài)的分析。ICP-MS 因其可以同時測定多種差異較大的元素，且準確性好、精密度高、檢測限低，而被廣泛應用于中藥材無機元素測定[10-11]。化學計量學是一門通過統(tǒng)計學或數(shù)學方法建立化學體系測量值與體系狀態(tài)之間聯(lián)系的學科，能將實驗中產生的海量數(shù)據(jù)進行提取分析，為中藥的復雜性和多樣性的分析提供切實的技術支持[12]。

本研究收集了6 個不同來源的陳皮，應用ICPMS 測定其中38 個無機元素含量，采用主成分分析（PCA）和神經網絡建模對數(shù)據(jù)進行進一步的分析，探討是否能通過元素對不同來源陳皮進行鑒別和區(qū)分，以期為陳皮的質量控制及資源開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ICAP-Q 型電感耦合等離子體質譜儀（賽默飛公司）；MM 400 型混合球磨儀（Retsch 公司）；AUW120D 型電子天平（島津公司）；Millipore Mill-Q型超純水機（Millipore 公司）；DST-1000 型酸純化器（Savillex公司）；Mars 6型微波消解儀（CEM公司）。

1.2 試藥

38 個元素標準品溶液由Muti-element Solution 1（批號：CL11-60YPY）和Muti-element Solution 2（批號：CL20-54YPY）混合標準品溶液配制而成（SPEX CertiPerp 公司）；硝酸（分析純，默克公司，由酸純化器二次純化）；過氧化氫溶液（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；水為經Millipore Milli-Q水處理系統(tǒng)處理后的去離子水。

陳皮藥材分別收集于四川、廣東、安徽、廣西、江西、重慶6 個省或直轄市，共36 批，見表1。所有樣品經中國中醫(yī)科學院中藥資源中心楊健副研究員鑒定均為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。樣品經球磨儀打粉后過60目篩，在干燥條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 陳皮樣品信息

2 方法與結果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率：15 500 W；采樣深度：5.0 mm；輔助氣和載氣（均為氬氣）流速分別為0.80、1.05 L·min-1；冷氣流流速：14.0 L·min-1；霧化器類型：同心霧化器；霧化室溫度：2 ℃；掃描方式：STD 模式；采集點數(shù)：3；重復次數(shù)：3次。

2.2 混合標準品儲備溶液的配制

精密量取標準品溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋，制成各元素質量濃度均為10 μg·mL-1的混合標準品儲備溶液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩葮巳芤簽橄♂?000倍的Rh溶液（質量濃度為10 μg·mL-1）。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取陳皮粉末0.1 g置于消解罐中，加入過氧化氫溶液1 mL和硝酸5 mL，將消解罐密閉，用微波消解儀消解，消解程序見表2。消解完全后冷卻至室溫，冷卻完全后將消解罐放在電熱板上180 ℃趕酸至剩余1 mL，冷卻至室溫，轉移至10 mL量瓶，超純水定容，搖勻，過0.4 μm 濾膜，得無機元素供試品溶液。精密量取上述供試品溶液1 mL轉移至10 mL或50 mL量瓶中，用超純水定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，得Na、Al、Fe、Zn 元素和Mg、K、Ca 等其他元素供試品溶液。按相同方法制備空白對照溶液。

表2 陳皮樣品微波消解程序

2.4 線性關系考察

分別精密量取混合標準品儲備溶液適量，加2%硝酸溶液稀釋，分別配成含Mg、K、Ca質量濃度為20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1，含Na、Al、Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Rb、Sr、Ba、Cu質量濃度為1、2、5、10、50、100、200、500 ng·mL-1，含Li、Be、V、Co、Ga、Se、Y、Cs、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tl、Th、Ag、Cd、Hg、Pb 質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng·mL-1的系列混合標準品溶液，以計數(shù)比率為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。稀釋標準品溶液至信噪比（S/N）為3，此時各元素的質量濃度即為該元素的檢測限（LOD）。結果顯示，各元素的標準曲線線性關系相關系數(shù)（r）均在0.99 以上，線性關系良好。標準曲線見表3。

表3 陳皮中38個元素的標準曲線及線性范圍

2.5 精密度考察

精密稱取同一份混合對照品溶液，按2.1 項下條件連續(xù)進樣6 次。結果顯示，各元素質量分數(shù)的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 按2.1 項下條件進行測定。結果顯示，不同時間點各元素質量分數(shù)的RSD均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性考察

稱取同一批陳皮樣品粉末6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下條件進樣測定。結果顯示，各元素質量分數(shù)的RSD 為1.98%～9.65%，在痕量分析的要求下重復性良好，滿足測定要求。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知各元素含量的陳皮粉末樣品0.1 g，共3份，分別加入2.2項下各元素標準品儲備溶液適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件進行測定，記錄各元素的響應信號值。結果顯示，各元素的平均加樣回收率為87.5%～118.3%，RSD均小于13%，表明在痕量分析的要求下，各元素回收率良好，該方法有效可行。

2.9 樣品含量測定

分別精密稱取36 批不同來源的陳皮樣品，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下條件進樣測定，各樣品元素含量的測定結果見表4～6。

表4 不同來源陳皮樣品中Li等13個無機元素含量測定結果（n=3）

陳皮樣品中，K 元素平均質量分數(shù)最高，達到8 509.26 mg·kg-1；其次為Ca元素，為3 480.20 mg·kg-1；Mg 和Fe 元素的平均質量分數(shù)分別為610.93、145.35 mg·kg-1。而上述4 種元素變異系數(shù)最大的是Fe 元素，達到45.67%，表明不同來源陳皮中Fe 元素含量變異程度最大，其平均質量分數(shù)為17.42～304.10 mg·kg-1；其余變異系數(shù)均較小，Ca 元素變異系數(shù)為25.81%，其平均質量分數(shù)為1 249.99～6 423.41 mg·kg-1；Mg 元素變異系數(shù)為25.71%，其平均質量分數(shù)為321.11～857.18 mg·kg-1；K 元素變異系數(shù)為25.48%，其平均質量分數(shù)為4 927.31～14 049.42 mg·kg-1。Be、Eu、Dy、Ho 和Er 元素平均質量分數(shù)較低，均小于0.01 mg·kg-1，部分或大部分批次未檢出。經過檢測，各批次陳皮樣品中的Cd 質量分數(shù)較低，均在1 mg·kg-1以下，Pb 元素質量分數(shù)均未超過3 mg·kg-1，3 個重金屬元素均在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版限定范圍之內。而按照《中國藥典》2020 年版限定的Hg 元素質量分數(shù)≤0.2 mg·kg-1、Cu元素質量分數(shù)≤20 mg·kg-1，36 批陳皮樣品中Hg 質量分數(shù)均超標，超標率為100%，而Cu 質量分數(shù)有2 批樣品超標，為廣東新會（CP-21、CP-22）樣品，超標率為5.56%。即使是按照較為寬松的《美國藥典》限量標準，大部分陳皮樣品的Hg元素質量分數(shù)也超標嚴重，超標率達到94.44%，而Cu 元素質量分數(shù)均未超標。

2.10 陳皮無機元素間的相關性分析

陳皮各元素間存在一定的相關性，結果表明，陳皮中38個元素質量分數(shù)之間有193個呈極顯著正相關（P＜0.01），62 個呈顯著正相關（P＜0.05），2 個呈顯著負相關（P＜0.05），而不同來源陳皮無機元素間未出現(xiàn)極顯著負相關。

2.11 PCA

對不同來源陳皮的無機元素進行PCA，得到PCA特征值和貢獻率（表7）和因子載荷矩陣（表8）。主成分1 與Y、Pr、Nd、Gd、Dy 和Er 元素呈高度正相關，主成分2 與Mg 元素呈較高正相關，主成分3 與K元素呈較高正相關，又因為這3個主成分的總方差貢獻率達到了60%，所以可以認為Y、Pr、Nd、Gd、Dy、Er、Mg和K元素是陳皮的特征元素。

表7 陳皮無機元素PCA主成分的特征值及貢獻率

表8 陳皮無機元素PCA成分因子載荷矩陣

2.12 神經網絡建模

6 個來源共36 批樣品隨機分成訓練集和檢驗集，訓練集24 個，檢驗集12 個。將6 個不同來源的陳皮依次賦予1～6作為模型的輸出，分別為安徽亳州、廣西玉林、四川荷花池、江西樟樹、廣東新會和重慶云陽。首先將原始無機元素數(shù)據(jù)進行Z-score 標準化處理，用標準化之后的數(shù)據(jù)代替原始的38 個元素數(shù)據(jù)作為神經網絡單元的輸入，然后建立1個3層的陳皮來源BP（back propagation）神經網絡模型。神經網絡模型的網絡輸入層節(jié)點為38，隱藏層節(jié)點數(shù)為16，傳遞函數(shù)為Tanh（雙曲正切函數(shù)），輸出層節(jié)點數(shù)為6，傳遞函數(shù)為歸一化指數(shù)函數(shù)Softmax，該模型訓練集預測概率為100%，檢驗集預測概率為91.7%。BP神經網絡對12 批樣品檢驗集的預測結果見表9。

表9 BP神經網絡對陳皮12個樣品檢驗集的預測結果

表5 不同來源陳皮樣品中Se等13個無機元素含量測定結果（n=3）

表6 不同來源陳皮樣品中Y等12個無機元素含量測定結果（n=3）

3 討論

無機元素是植物生理代謝活動的重要參與者，也是植物次生代謝產物的構成因子，含量和種類的差異會對中藥材的藥效產生一定的影響[2]。韓麗琴等[13]通過對治療呼吸系統(tǒng)疾病中藥（如魚腥草、五味子、紫草、甘草、何首烏等）中Fe 元素和總黃酮的定量測定，發(fā)現(xiàn)治療呼吸系統(tǒng)疾病的中藥材均含有豐富的Fe 元素和黃酮類化合物。因杰秀等[14]研究58 味歸心經中藥材時發(fā)現(xiàn)，K 元素與Na 元素的平均含量之間存在顯著的負相關性，與現(xiàn)代醫(yī)學用藥遵循“高鉀低鈉”攝入的服用原則相吻合，是歸心經中藥中無機元素的含量特征之一，證實了傳統(tǒng)的歸心經中藥在選藥、用藥上的科學性，因此，無機元素應是中藥品質評價的重要指標之一。中藥材無機元素的含量會受到產地、氣候、采收時間、加工方法等一系列因素的影響[10]，不但影響藥效的發(fā)揮，也給中藥的質量控制帶來困難。本研究建立了ICP-MS測定陳皮中K、Ca 等38 個無機元素含量的方法，分析發(fā)現(xiàn)測定的38個元素中K、Ca、Mg和Fe這4種元素平均質量分數(shù)最高，分別為8 509.26、3 480.20、610.93、145.35 mg·kg-1，而Be、Eu、Dy、Ho 和Er等元素平均質量分數(shù)較低，均小于0.01 mg·kg-1，部分批次未檢出。利用化學計量學對不同來源的陳皮樣品進行統(tǒng)計分析，PCA 表明，Y、Pr、Nd、Gd、Dy、Er、Mg 和K 是陳皮的特征元素；而建立的BP神經網絡模型可以很好地區(qū)分不同來源的陳皮樣品，訓練集樣品正確率為100%，檢驗集正確率為91.7%。該方法快速、準確，結果可靠，可為陳皮藥材的質量控制、品種選育綜合利用提供參考。