基于網絡藥理學的六味地黃丸治療高血壓作用機制探討△

劉云寬，高敏，林柳任，張昆，蔡俊飛，馬云淑，3*

1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；

2.昆明理工大學，云南 昆明 650500；

3.云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，云南 昆明 650500

高血壓是一種常見的慢性病，同時也是引發心血管病的最主要危險因素，控制高血壓是預防心血管疾病的關鍵措施[1]。目前，高血壓治療以藥物治療為主，如使用鈣拮抗劑、利尿劑、β受體阻斷劑等，但這些藥物普遍存在不良反應較多、作用時間短、需終身服用等缺點[2-3]。六味地黃方是我國中醫滋陰補腎的經典名方，至今已有近千年的應用歷史。近期臨床研究發現，其能顯著改善高血壓患者的收縮壓和舒張壓[4]，對老年性高血壓、女性更年期高血壓、糖尿病合并高血壓及高血壓早期腎損傷均有良好的治療效果[5-8]，其與臨床常用的治療高血壓的化學藥物聯合應用時顯示出更優的治療作用[9]。但六味地黃丸治療高血壓的分子作用機制尚未明確。本研究采用網絡藥理學方法，收集六味地黃丸有效化合物及預測其治療高血壓的可能作用靶點，并通過富集分析揭示其治療高血壓的可能分子機制，為六味地黃丸治療高血壓的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 六味地黃丸有效化合物的收集與作用靶點的預測

在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中，以“熟地黃”“山藥”“山茱萸”“茯苓”“澤瀉”“牡丹皮”作為檢索詞收集其化合物，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選出有效化合物[10-11]，記錄化合物的MOL號，并將下載的MOL結構輸入PharmMapper平臺（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預測作用靶點，篩選矯正分數（Norm Fit）≥0.7 的靶點，用STRING v11.0 平 臺（https://string-db.org/）矯 正基因名。

1.2 六味地黃丸對高血壓作用靶點的預測

在GeneCards 數據庫中（https://www.genecards.org/）以“hypertension”檢索高血壓相關靶點，選擇相關度得分≥20 的靶點作為高血壓靶點，并與六味地黃丸的預測靶點一同輸入Venny 2.1平臺，得的共同靶點即為六味地黃丸對高血壓的作用靶點，通過Cytoscape 3.6.1軟件建立化合物-靶點網絡。

1.3 六味地黃丸作用于高血壓靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

將共有靶點輸入STRING v11.0 平臺得到靶點的相互聯系網絡，并用Cytoscape 3.6.1 軟件進一步構建其PPI網絡。

1.4 六味地黃丸作用于高血壓靶點的基因本體（GO）富集與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

在DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中導入共有靶點，從生物過程、細胞成分和分析功能進行GO 富集分析，使用GraphPad Prism 7 軟件將P＜0.05 的結果可視化；以KEGG 進行通路分析，用R 語言將P＜0.05 的結果生成可視化氣泡圖。

1.5 分子對接驗證

使用AutoDock 軟件對六味地黃丸中的成分和PPI網絡中的蛋白進行分子對接驗證，并通過所得的binding-energy 得分評價化學成分與靶點間的對接效果。

2 結果

2.1 六味地黃丸有效化合物

由1.1 項下的檢索方法，得到熟地黃有效化合物2 個，山藥有效化合物16 個，山茱萸有效化合物20個，茯苓有效化合物15個，澤瀉有效化合物10個，牡丹皮有效化合物11 個，見表1。除去藥材間重復化合物，得到六味地黃丸有效化合物共69 個，共預測并校正得到5495 個靶點的標準基因名，刪除重復靶點后剩余269個靶點。

表1 六味地黃丸有效化合物

續表1

2.2 六味地黃丸對高血壓的作用靶點

GeneCards 數據庫共檢索出7913 個高血壓相關靶點，相關度得分≥20 的靶點有176 個。通過Venny 2.1 平臺交互六味地黃丸與高血壓的靶點，得到六味地黃丸作用于高血壓的靶點共14 個，見表2。將藥材與其有效化合物相聯系，共得到74 對相關的聯系；將每個化合物和其作用于高血壓的靶點相聯系，共得到545 對相關的聯系，通過Cytoscape 3.6.1 軟件構建藥物-化合物-靶點網絡，見圖1。結果表明，六味地黃丸治療高血壓的主要成分是茯苓酸、澤瀉醇、芍藥苷、谷甾醇、豆甾醇等。

圖1 六味地黃丸作用于高血壓的藥物-化合物-靶點網絡

表2 六味地黃丸作用于高血壓的靶點

2.3 六味地黃丸對高血壓作用靶點的PPI網絡

將14 個共有靶點導入STRING v11.0 數據庫中，設置靶點之間最低要求的聯系分數為0.4，將結果輸入Cytoscape 3.6.1 得到PPI 網絡，見圖2。結果顯示，網絡中有14 個節點、35 條邊，血清白蛋白（ALB）、一氧化氮合酶3（NOS3）、表皮生長因子受體（EGFR）、腎素（REN）是其主要的作用靶點。

圖2 六味地黃丸對高血壓作用靶點的PPI網絡

2.4 六味地黃丸作用于高血壓靶點的GO 富集與KEGG通路分析

將共有靶點輸入DAVID 數據庫中，GO 富集分析結果體現在生物過程（BC）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）3 方面，在P＜0.05 條件下，這3 個方面分別得到35、7、11 個條目，取前10 個條目用GraphPad Prism 7 軟件作成可視化條形圖，見圖3。KEGG 通路富集分析得到6 條通路（P＜0.05），分別是黏附連接（adherens junction）、胰腺癌（pancreaticcancer）、破骨細胞分化（osteoclast differentiation）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）、癌癥途徑（pathways in cancer）、腎素-血管緊張素系統（reninangiotensin system，RAS）。黏附連接通路由4個基因靶點共同調控，分別是轉化生長因子-β受體Ⅰ（TGFBR1）、轉化生長因子-β受體Ⅱ（TGFBR2）、表皮生長因子受體（EGFR）、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）；胰腺癌通路由3 個基因靶點共同調控，分別是TGFBR1、TGFBR2、EGFR；破骨細胞分化通路由3 個基因靶點共同調控，分別是TGFBR1、TGFBR2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）；FoxO信號通路由3個基因靶點共同調控，分別是TGFBR1、TGFBR2、EGFR；癌癥途徑通路由4 個基因靶點共同調控，分別是TGFBR1、TGFBR2、PPARG、EGFR；RAS 通路由2 個基因靶點共同調控，分別是血管緊張素轉換酶2（ACE2）、REN，將分析結果用R 語言生成可視化氣泡圖，見圖4。

圖3 六味地黃丸對高血壓作用靶點的GO富集分析

圖4 六味地黃丸對高血壓作用靶點的KEGG分析

2.5 分子對接驗證

采用AutoDock 軟件對藥物-化合物-靶點網絡中相關度值排名前10 位的化合物與PPI 網絡中自由度較高的前4 個靶點進行分子對接。通過PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載ALB、NOS3、EGFR、REN 的PDB 文件，于PyMOL 軟件移除水分子和配體分子，AutoDock 軟件分別對接靶點與化合物，最后將對接好的PDBQT文件導入PyMOL軟件中，顯示化合物和靶點相結合的位點圖。分子對接結果中，蛋白質與化合物結合越緊密，結合能（binding energy）值越低，見表3。結合較緊密的前5 組分子對接見圖5。

圖5 六味地黃丸中作用于高血壓的化合物與核心靶點的分子對接

表3 六味地黃丸作用于高血壓的化合物-靶點分子對接

3 討論

高血壓的臨床癥狀表現為頭痛頭暈、疲勞心悸、頸項板緊等，在傳統中醫學中可歸屬于“眩暈”“頭痛”“中風”等范疇，常見于中老年人，在年輕人中發病較少。黃興等[12]認為，中老年人高血壓因體內的腎氣虧虛、臟腑功能失調而致，在治療中應重視補腎臟、調陰陽。六味地黃丸是滋陰補腎的經典名方，對高血壓有明顯改善、治療作用[13-14]，相關分子機制仍需不斷探索。

本研究結果顯示，六味地黃丸的69 個有效化合物可作用于14 個高血壓靶點。茯苓酸B 作用于高血壓的靶點數最多（12 個），5-{[5-(4-methoxyphenyl)-2-furyl]methylene}barbituric acid 作用于高血壓的靶點數最少（2 個），說明六味地黃丸治療高血壓時確實存在多成分、多靶點的特點。alisol，b，23-acetate 及茯苓酸B 能抑制血管緊張素Ⅱ誘導的RAS/Wnt/βcatenin 軸的激活，減輕人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2 和足細胞的損傷，其中血管緊張素Ⅱ激活RAS，能引起高血壓、慢性腎臟病發生[15]；槲皮素、山柰酚、豆甾醇具有抗低密度脂蛋白氧化和抗血小板聚集作用，具有保護心血管的活性[16]。

六味地黃丸作用于高血壓14 個靶點的PPI 網絡顯示，每個靶點與其他靶點聯系的個數依次是ALB（12 個）、NOS3（9 個）、EGFR（8 個）、REN（7個）、F2（5個）、PPARG（5個）、TGFBR1（4個）、PTPN1（4 個）、ACE2（4 個）、NR3C2（4 個）、SELP（3 個）、TGFBR2（2 個）、TTR（2 個）、GBA（1個），其中靶蛋白ALB、NOS3、EGFR、REN 在蛋白相互作用網的度值較高，說明六味地黃丸可能通過以上靶點治療高血壓。王建國[17]報道高血壓性腦出血患者的血腫周圍的水腫程度與ALB 水平呈負相關，ALB 能通過調節凝血功能、降低炎癥因子毒性、保護大腦微循環的途徑改善腦功能；NOS3是心血管系統中重要的氧化應激相關因子，能雙重調節血壓，NOS3 可產生NO 來舒張血管從而降低血壓，也能產生超氧陰離子后繼而氧化成亞硝酸鹽，起到促高血壓作用[18]；EGFR 可以調節血管張力和組織的平衡，也可以參與誘導促炎介質生成，增強血管平滑肌細胞的增殖及血管重構，從而加劇高血壓等血管疾病的發展[19]。

GO 富集分析結果顯示，六味地黃丸治療高血壓的相關生物過程有活性氧代謝過程的調控、對雌激素的反應、血壓調節、傷口愈合、細胞生長調節、基因表達調控、上皮-間充質轉化（EMT）參與心內膜墊形成的調節、細胞增殖調控、血小板活化的負調節等。Yeasmin 等[20]報道，絕經后婦女的高血壓與血清中雌激素水平有關，血清雌激素水平與收縮壓和舒張壓水平呈負相關。在血管損傷方面有關鍵作用的是氧化應激，高血壓人群體內的活性氧生成明顯增多，抗氧化治療能減小血管損傷、降低高血壓導致的終末器官損傷[21]。高血壓能引起腎臟并發癥，如腎纖維化，而EMT 在腎纖維化過程中起重要作用，抑制EMT 能改善高血壓對腎的損傷[22]。有高血壓病史的患者體內低密度脂蛋白膽固醇增高會引起腦梗死，但過低會增加腦出血風險[23]。心房顫動（AF）是較為常見的心律失常，能引發嚴重的并發癥而危及生命，其中高血壓患者血清中的血管緊張素轉化酶升高和左房內徑擴大增加了AF的發生，注重高血壓患者血清血管緊張素轉化酶水平與左房內徑能預防AF發生[24]。

KEGG 通路富集結果顯示，六味地黃丸靶點富集的高血壓相關通路有黏附連接、胰腺癌、破骨細胞分化、FoxO 信號通路、癌癥途徑、RAS。原發性高血壓（EH）能促進內皮細胞和白細胞表面黏附分子的表達，這會導致內皮細胞功能紊亂及內皮損傷[25]。李小兵等[26]報道可溶性細胞間黏附分子（sICAM1）、可溶性血管細胞黏附分子（sVCAM1）在痰濕證原發性高血壓患者中顯著升高；平靜娜等[27]報道，代謝綜合征及其包括的新發糖尿病、體質量指數增高、高血壓等代謝性疾病都是胰腺癌發生的危險因素；高血壓患者中骨質疏松的發病率遠高于正常人，可能是因為高血壓引起機體某些激素水平變化，而導致老年人骨形成率降低，但破骨細胞分化、成熟和骨吸收活性相對活躍，最終導致骨質疏松，預防骨質疏松能減少及延緩高血壓對靶器官的損害[28]。氧化應激反應通過PI3K/FoxO 信號通路傳導及表達相關的酶和蛋白，從而引發血管內皮損傷，導致血栓形成[29]。惡性腫瘤和高血壓都屬于增殖性病變，高血壓引起的血流動力學的改變及易栓塞傾向能加快腫瘤的發展，推動腫瘤的進程[30]。RAS屬于內分泌系統，在機體中維持水電解質平衡、血壓穩定、心血管系統穩定，抑制RAS 的過度激活能穩定調節細胞生長、細胞內水-鈉平衡及心血管微環境，從而控制血壓[31]。這些均與網絡藥理學的生物功能注釋和通路分析一致。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法揭示了六味地黃丸治療高血壓時存在的可能分子機制。研究結果表明，六味地黃丸通過多活性成分、多靶點、多途徑發揮抗高血壓作用，為該制劑的進一步藥效物質基礎分析和機制研究提供參考。