多信息G1-熵權組合賦權法優(yōu)選醋當歸炮制工藝△

王慧楠，張桂梅，楊子燁，王佩華，陳夢雨，岳珠珠，姜明瑞，王志成，張婧秋，王英姿

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，最早記載于《神農本草經》，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效[1-2]。當歸的炮制方法最早記載于《劉涓子鬼遺方》，自南北朝到清朝，歷代古籍記載的炮制方法有多種，主要包括酒炙、清炒、土炒、醋制及其他炒法。

醋制是最常見、最有效的中藥飲片炮制方法之一。中醫(yī)藥理論認為，醋性溫，味酸、苦，入肝、胃經，能起到活血化瘀、散瘀止痛、疏肝行氣的作用，也能入血分，有收斂氣血、止血消腫的功效[3]。醋當歸在古代應用廣泛，艾煎丸、六一丸、小薊飲子等均以醋當歸入方來治療血虛氣滯、寒冷帶下、月經失調等婦科疾病。現代藥理研究也表明，醋當歸在凝血方面具有顯著的調節(jié)作用[4]，可用于治療凍瘡及崩漏帶下、月經不調等婦科疾病。為了更加深入研究中藥飲片醋制工藝，本研究以阿魏酸、醇浸出物以及體外凝血時間的綜合評分為指標，考查炒制溫度（A）、炒制時間（B）、米醋用量（C）及悶潤時間（D）對醋當歸炮制工藝的影響，采用G1-熵權組合賦權法計算各指標權重，以期豐富醋制炮制方法研究，為醋制中藥炮制工藝優(yōu)選提供新思路與新方法。

1 材料

島津高效液相色譜儀（SIL-20A型自動進樣器類型、SPD-20A 型紫外-可見檢測器、CTO-10A SVP 型柱溫箱）；DHG-9030A 型電熱干燥箱（北京北方利輝實驗儀器設備有限公司）；BSI10 型萬分之一電子天平（Sartorius 公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；KH7200DB 型超聲清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；MS-5 型炒貨機（臺州博大制藥機械科技有限公司）；ZN-02 型粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）；CA550 型凝血分析儀（日本Sysmex公司）。

米醋為恒順鎮(zhèn)江香醋（批號：6902007115180）；凝血功能檢測所用的兔血漿購自上海源葉生物科技有限公司（批號：J01M10S81673）；乙腈、甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純，批號分別為164793、165503）；阿魏酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110773-201614）；0.9%氯化鈉溶液（石家莊石藥有限公司，批號：1901013202）；凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）試劑（Sysmex，批號分別為R8038、R8034、48066）；實驗用水為純凈水；其他試劑為分析純。

當歸飲片購自北京鶴延齡中藥飲片公司，批號：DC5061，經北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為傘形科當歸屬Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法與結果

2.1 醇浸出物含量測定

以《中華人民共和國藥典》2020 年版四部2201中浸出物測定法中的熱浸法為測定依據，以70%乙醇為溶劑，測定供試品溶液中醇浸出物的含量[5]。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 對照品溶液配制 準確稱取阿魏酸對照品4.98 mg，在25 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，得對照品儲備液；然后準確量取對照品儲備液1.5 mL，在50 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，搖勻，得到質量濃度為11.95 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液[6]。

2.2.2 供試品溶液配制 取當歸粉0.2 g（過三號篩），準確稱取，置于50 mL 具塞錐形瓶中，再加入70%甲醇20 mL，稱量，在80 ℃水浴加熱條件下回流30 min，冷卻，稱質量，加入70% 甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，得到供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.085%磷酸(17∶83)作為流動相；檢測波長：316 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；進樣時間：30 min；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 標準曲線繪制 準確稱取阿魏酸對照品，配制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，進樣檢測，以峰面積為縱坐標（Y），樣品質量濃度為橫坐標（X），回歸方程：Y=67 997X+29 790，r=0.999 6。

2.2.4.2 精密度考察 準確稱量2.2.1 項下對照品溶液10 μL，進樣，連續(xù)測定6 次，阿魏酸峰面積的RSD為0.22%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復性試驗 準確稱量6 份同一批制備的醋當歸粉，按照2.2.2 項下方法制備供試品溶液，取10 μL 注入高效液相色譜儀，計算出阿魏酸質量分數的RSD為2.46%，說明該方法重復性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 準確稱取同一批制備的醋當歸樣品粉，按照2.2.2 項下的方法制備供試品溶液，取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、10、12 h連續(xù)進樣1次，記錄峰面積，計算阿魏酸峰面積的RSD為0.23%，說明該供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 準確稱量6個已知指標成分含量的供試品，按比例1∶1準確加入阿魏酸對照品，按2.2.2項下的方法配制供試品溶液，取10 μL 進樣，檢測阿魏酸的含量，并計算回收率。結果顯示，各樣品中阿魏酸的加樣回收率為99.78%～103.65%，平均加樣回收率為101.74%，RSD為1.53%。

2.3 凝血功能考察

2.3.1 樣品溶液配制 稱取生當歸和醋當歸粉2.0 g，準確稱質量，分別加入0.9%氯化鈉溶液10 mL，超聲30 min，4000 r·min-1離心5 min（離心半徑為10 cm），取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，得到質量濃度為0.1 g·mL-1的當歸原液和質量濃度為0.13 g·mL-1的醋當歸提取液。

2.3.2 凝血功能指標測定 精密量取生當歸提取液和醋當歸提取液150 μL，分別加入兔血漿350 μL，采用全自動凝血儀測定空白組、生當歸組、醋當歸組的PT、APTT、TT值[7]。

2.4 數據處理

2.4.1 G1 法主觀賦權 據古籍記載和現有文獻報道[4]，隨著用法用量的不同，醋當歸對凝血的調節(jié)作用會存在顯著差異，因此，凝血功能指標與有效成分指標相結合能更直接地反映出醋當歸飲片的質量與藥效作用[8]。阿魏酸是醋當歸的主要藥效物質，具有良好的抗凝血作用，與醇浸出物相比，其含量、溶出率的變化與當歸炮制后藥效作用變化有更密切的聯系[9-10]。因此，依據醋當歸藥效物質功效及凝血功能相關指標特征，將5 個評價指標順序關系設定為PT＞APPT＞TT＞阿魏酸＞醇浸出物，并對相鄰2 個指標的重要性之比進行賦值，依次為r2（y1與y2）=1.1，r3（y2與y3）=1.1，r4（y3與y4）=1.3，r5（y4與y5）=1.1，以rk為標準計算各指標的主觀權重系數，按公式（1）計算[11]。

式中，rk=yk-1/yk，k=m，m-1，……，3，2。其中，wk表示主觀權重系數，yk-1與yk為評價指標，rk為相鄰2個指標的重要性之比。

2.4.2 熵權法客觀賦權 數據標準化：假設一共有n個待比較的物體，k個特征數，某個特征一共n個特征值X1j，X2j，……，Xij，Xnj，對每個Xi都進行標準化處理[12]。

式中，X表示各指標成分的含量，Y表示各指標成分含量經標準化處理之后的數值。

按公式（3）每個樣品的某個特征值在這個特征中所占的權重。

式中，r表示各指標成分含量經標準化處理之后的數值，f表示各指標成分的某個值在此指標成分所有值中所占的權重，n表示各評價指標的測量次數。

按公式（4）計算各特征的信息熵。

式中，f表示各指標成分的某個值在此指標成分所有值中所占的權重，s表示各指標成分的信息熵，n表示各評價指標的測量次數。

按公式（5）計算各特征的信息熵權重。

式中，s表示各指標成分的信息熵，w表示各指標成分的客觀權重系數，m表示評價指標的個數。

2.4.3 組合權重的確定 綜合權重按公式（6）計算。

式中，w1表示主觀權重系數，w2表示客觀權重系數。

2.4.4 歸一距離評價法采用歸一距離評價法對驗證實驗的數據進行處理，按公式（7）計算。

式中，di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)，Y代表各指標成分的含量。

綜合指標代表采用的實驗方法距離最優(yōu)值的距離，綜合指標越接近0 表示各評價指標的工藝參數越優(yōu)，優(yōu)選出的炮制工藝越好。

2.5 正交試驗

以炒制溫度、炒制時間、米醋用量和悶潤時間為因素，分別以醋當歸中的阿魏酸、醇浸出物含量、PT、APTT、TT為評價指標，采用L9（34）正交設計，對醋當歸的加工工藝進行優(yōu)化，各指標因素水平設計見表1。

表1 醋當歸炮制工藝正交試驗優(yōu)選的因素水平設計

將正交試驗制備的醋當歸飲片分別進行阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 的測定，采用更加客觀公正的G1-熵權組合賦權法對含量進行分析，得出綜合評分，對綜合評分進行正交和直觀分析，正交試驗結果見表2～3，采用G1-熵權法計算各考察指標權重，結果見表4～5，實驗安排和直觀分析見表6。

表2 醋當歸炮制工藝考察結果（±s,n=3）

表2 醋當歸炮制工藝考察結果（±s,n=3）

表3 不同生當歸和醋當歸飲片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表3 不同生當歸和醋當歸飲片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表4 醋當歸炮制工藝5種考察指標成分客觀權重

依據表3 數據可知，生當歸組的PT、APTT、TT值高于空白組，而醋當歸組的PT、APTT、TT值部分高于生當歸組，表明醋當歸也可能表現出一定的抗凝血作用。由表5可知阿魏酸、醇浸出物、PT、APTT、TT的組合權重值依次為0.081 6、0.104 6、0.451 7、0.231 6、0.130 6，表明PT、APTT、TT 對醋當歸飲片的質量影響較大。由表6 中的醋當歸化學指標及抗凝血指標數據可知，各因素對醋當歸飲片質量的影響順序為C＞B＞A＞D，綜合正交和直觀分析可知，醋當歸的最優(yōu)炮制條件為A2B2C1D2，即每100 g 當歸飲片加米醋15 mL，悶潤1 h，150 ℃炒制20 min。

表5 醋當歸炮制工藝5種考察指標成分的組合權重

表6 醋當歸炮制工藝正交試驗設計及直觀分析

2.6 驗證實驗

取生當歸飲片，按確定的醋當歸炮制工藝參數進行炮制，測定阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 值，結果見表7。由驗證實驗數據可知，平均指標為1.32，表明優(yōu)選出的工藝參數合理，醋當歸炮制工藝穩(wěn)定可靠。

表7 醋當歸炮制工藝驗證結果（±s,n=3）

表7 醋當歸炮制工藝驗證結果（±s,n=3）

3 討論

當歸含有阿魏酸、揮發(fā)油、多糖、黃酮等化學成分[13]，主要被用來治療血虛諸證，為婦科血病之圣藥。古籍記載以醋當歸入方可用于治療寒冷帶下、血虛氣滯、月經失調、閉經痛經。APTT、PT、TT是反映內源性、外源性和共同凝血途徑的常見指標[14-15]。本研究同時選用阿魏酸、醇浸出物含量、體外凝血時間（APTT、PT、TT）為考察指標，區(qū)別以往僅以有效成分為評價指標優(yōu)選醋當歸炮制工藝的方法，可更加全面、客觀地評價炮制工藝的優(yōu)劣。

各指標權重系數的確定是多指標評價中藥飲片炮制工藝的重要問題。確定權重的方法有客觀賦權法和主觀賦權法，G1 賦權法是在層次分析法（AHP）基礎上改進的一種主觀賦權法[16]。熵權法是利用各指標所反映的信息量來確定權重的一種客觀賦權法[11]。本研究采用G1 主觀賦權法和熵權客觀賦權法，綜合了不同賦權法的優(yōu)點，可全面準確地確定各個指標權重，使醋當歸炮制工藝優(yōu)選結果更為合理、可靠。

清代《本草述鉤元》中記載了醋當歸的使用用法和用量，“如吐衄崩下藥中，須醋炒過，少少用之，多則反能動血”[17]。已有文獻證實，醋當歸能夠促進凝血止血。本研究由于醋當歸用量偏大，結果顯示，醋當歸具有一定的抗凝血活性，提示醋當歸較高用量可能表現出抗凝血作用，與古籍記載一致。

炮制輔料醋含有醋酸、維生素、乙醇、乙醛、還原糖、氨基酸等成分，本身具有一定的藥理作用。明代《本草蒙筌》中記載道“醋注肝，且資止痛”，說明中藥經醋炮制后，可引藥入肝經，增強其活血化瘀、祛瘀止痛、疏肝益氣的功效[18]。現代研究也表明，醋制法是輔料醋與炮制中藥相互作用進而導致中藥化學成分或藥理作用發(fā)生變化的一種復雜過程，可能通過增加有效成分的含量、溶出量或溶解度起到增加中藥藥效的作用[19]。當歸經醋制后表現出一定的抗凝血活性，推測可能與阿魏酸等有效成分的提取率增加有關。

中醫(yī)藥理論認為，肝主藏血，主疏泄，有調節(jié)情志、調節(jié)氣血、儲藏血液的功能。女子以血為用，以肝為先天，易憂郁，郁則氣滯血滯，故婦科疾病的發(fā)生多由肝經失調所致[20]。古今文獻均表明，醋當歸對月經不調、血虛氣滯等婦科疾病具有很好的治療效果，有一定的臨床價值，可能與醋入肝經，炮制后可增強藥物疏肝行氣、化瘀止痛的功效有關[21]。但是目前關于醋當歸的相關研究較少，因此，本研究通過正交試驗設計，利用G1-熵權組合賦權法和多指標綜合評分法優(yōu)選了醋當歸飲片的炮制工藝，結合凝血功能指標驗證了優(yōu)選出的醋當歸炮制工藝穩(wěn)定可行，對完善當歸炮制理論、豐富醋制炮制法研究、傳承中藥傳統(tǒng)炮制技術具有重要意義。