Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)選加味結(jié)石湯的提取工藝△

胡靜，汪毓文，徐林忠，夏志持

麻城市人民醫(yī)院 藥劑科，湖北 麻城 438300

加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方，由金錢草、連錢草、山楂、雞內(nèi)金、車前子、滑石等12 味中藥組成，具有清熱利濕、通淋消石的功效，臨床用于濕熱引起的肝膽結(jié)石、黃疸、尿路結(jié)石、石淋、熱淋、小便澀痛等[1-3]。鑒于傳統(tǒng)湯劑臨床服用攜帶不便、質(zhì)量不可控等缺點(diǎn)，為了保證臨床效果，故擬將該方開發(fā)研制成加味結(jié)石顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)以總黃酮提取率和干浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)[6]，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對該顆粒劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以期為臨床院內(nèi)制劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

53-WB 型紫外-可見分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器廠）；WGL-230B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；QUINTIX125D-1CN 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-6型恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

金錢草（批號：191001-X）、連錢草（批號：190501-X）、山楂（批號：20190801）、雞內(nèi)金（批號：20191001）、車前子（批號：20191001）等購于亳州市善安堂中藥飲片有限公司，經(jīng)麻城市人民醫(yī)院藥劑科主任中藥師徐林忠鑒定為正品；對照品蘆丁（純度：98%，批號：190705，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品12.61 mg，置25 mL量瓶中，加70%乙醇約20 mL，密塞，超聲使其溶解，放冷，定容，即得（0.5045mg·mL-1）。

2.1.2 樣品溶液的制備 取0.2 倍量處方中藥，加入適宜體積的水，浸泡30 min，提取相應(yīng)次數(shù)，濾過，濾液合并，濃縮至適量，放冷至室溫，加水定容至50 mL量瓶中，備用。精密吸取提取液5 mL，置50 mL量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，超聲20 min，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL置5 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

2.1.3 最大吸收波長的確定 分別吸取對照品和樣品溶液各1 mL，使用硝酸鋁顯色法，于200～800 nm波長處掃描，發(fā)現(xiàn)兩者均在510 nm 的波長處有最大吸收（圖1），故選用510 nm 作為檢測波長。

圖1 加味結(jié)石湯供試品溶液和蘆丁對照品溶液紫外掃描圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1 項(xiàng)下對照品溶 液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，70%乙醇定容至10 mL，混勻，靜置15 min[4]。以相應(yīng)試劑為空白對照，在510 nm 處測吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=0.011 5X-0.001 1（r=0.999 8），在12.36～74.16μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.037 08 mg·mL-1的對照品溶液，按2.1.4 項(xiàng)下方法，連續(xù)測定6 次，RSD為0.13%，表明儀器精密性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取同一份樣品溶液1.0 mL，按2.1.4 項(xiàng)下方法，于5、10、15、20、25、30 min測定，RSD 為0.55%，表明供試品溶液在30 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取0.2 倍量處方藥材，按照樣品制備方法（液料比為12∶1，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為2 次）平行煎煮6 份樣品，按2.1.4 項(xiàng)下方法測定吸光度值并計(jì)算總黃酮含量，RSD 為1.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定0.1 倍量處方藥材，共6份，精密加入蘆丁對照品溶液適量（與0.1倍處方藥材所含黃酮量相當(dāng)），按照樣品制備方法（液料比為12∶1，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為2次）煎煮樣品，按2.1.4項(xiàng)下方法測定吸光度，測得平均回收率為97.78%，RSD 為2.91%，加樣回收率符合要求。

2.2 干膏得率的測定

精密吸取樣品提取液20 mL，放置于蒸發(fā)皿（經(jīng)干燥至質(zhì)量恒定），在水浴中蒸干，保持105 ℃溫度條件，5 h 后于干燥器冷卻1 h。快速稱取質(zhì)量，根據(jù)公式（1）計(jì)算出膏率[5]。

式中，W為出膏質(zhì)量，M為藥材質(zhì)量，V為樣品溶液的體積。

2.3 單因素試驗(yàn)

以總黃酮含量和干膏得率為指標(biāo)，采用加權(quán)綜合評分法，兩者的權(quán)重分別為50、50，按公式（2）計(jì)算綜合評分[6]。

對液料比（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）、煎煮時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、煎煮次數(shù)（1、2、3 次，考慮到成本和實(shí)際生產(chǎn)，煎煮次數(shù)試驗(yàn)只選1、2、3 次）這些因素進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，加水量為12 倍時綜合評分最高，煎煮時間為1.5 h時綜合評分最高，綜合評分隨著煎煮次數(shù)的增加而增加，煎煮次數(shù)為2 次時，綜合評分急劇增加，當(dāng)煎煮次數(shù)達(dá)到3 次時，綜合評分曲線增加變緩，說明繼續(xù)增加煎煮次數(shù)已無實(shí)質(zhì)性意義。

2.4 Box-Behnken法優(yōu)化加味結(jié)石湯提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）3 個因素作為考察對象，每個因素三水平（表1），根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，總共設(shè)計(jì)17組，見表2，采用Design-Expert 8.0.6軟件對綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3。

表1 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6 對表2 中各指標(biāo)性成分的綜合權(quán)重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得回歸方程：Y=97.20-0.33A-2.38B+4.53C+0.95AB-3.57AC-1.97 BC-5.22A2-11.24B2-8.16C2，3個因素中對加味結(jié)石湯提取工藝影響結(jié)果依次為C＞B＞A。回歸模型P＜0.000 1，說明此模型具有顯著性，且r=0.988 6，表明模型擬合度良好，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬不顯著，試驗(yàn)誤差小，說明可以很好地對加味結(jié)石湯的提取工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。

2.4.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)面曲面圖，見圖2，從圖2可以看出，兩兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響，隨著各因素的水平值增加，綜合評分值會出現(xiàn)一個峰值，當(dāng)各水平持續(xù)升高時，綜合評分值又下降或坡度相對平緩，如隨著煎煮時間的增加，綜合評分先升高后下降，煎煮次數(shù)由1 次升高為2 次時，提取效率顯著升高，當(dāng)煎煮次數(shù)增加為3 次時，曲面相對平緩。使用Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化過后的最佳提取工藝條件為液料比11.37∶1，煎煮時間1.46 h，煎煮次數(shù)2.31 次，在此條件下，綜合評分最大值為97.95。考慮到實(shí)際操作過程中的局限性，將各參數(shù)調(diào)整為液料比12∶1，煎煮時間1.5 h，煎煮次數(shù)2次。

圖2 加味結(jié)石湯各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

進(jìn)一步對提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，考察所得優(yōu)化后的提取工藝的穩(wěn)定性，按照處方比例稱取藥材3 份，加12 倍量水，煎煮2 次，每次1.5 h，測得總黃酮平均提取率為2.29%，干膏得率為22.20%，都接近響應(yīng)面法最優(yōu)數(shù)據(jù)的理論值，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇了干膏得率和總黃酮含量作為雙指標(biāo)，其原因?yàn)闈飧嗟某龈嗦蕦χ苿┖罄m(xù)的醇沉、制粒等工藝操作影響較大[7]，另一方面加味結(jié)石湯方中重用金錢草、連錢草為君藥，兩者質(zhì)量占整個方子總量的40%，金錢草、連錢草主要化學(xué)成分均為黃酮類[8-10]。研究報(bào)道，金錢草的利尿排石作用機(jī)制可能為提取液中黃酮類成分的羰基和酚羥基與草酸根競爭性結(jié)合鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，從而達(dá)到減少草酸鈣的形成[7，11]。

響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取，該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高且能夠研究幾種因素間的交互作用[12-13]，與傳統(tǒng)方法相比，能更直觀、更準(zhǔn)確得到最優(yōu)組合。

肝膽結(jié)石和泌尿系統(tǒng)結(jié)石是臨床的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率呈逐年增高趨勢，并嚴(yán)重危害人類的健康和生命[1,14]。加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方，該方以中藥傳統(tǒng)方《太平惠民和劑局方》記載的八正散（車前子、瞿麥、扁蓄、滑石、梔子、甘草、木通、大黃）加減所得[15]，根據(jù)藥物特點(diǎn)，可同時兼顧治療肝膽結(jié)石和尿路結(jié)石。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為該方開發(fā)成治療結(jié)石的顆粒制劑提供參考。