湖南省稻田養殖的不同規格克氏原螯蝦的肌肉營養成分分析

羅雅婷 劉 益 劉金夢 肖調義,2* 劉巧林,2*

(1.湖南農業大學,動物科學技術學院，長沙 410128；2.湖南農業大學，湖南省特色水產資源利用工程技術中心，長沙 410128)

近年來，我國克氏原螯蝦稻田養殖產業不斷擴大，發展勢頭良好，產業化前景廣闊，已成為我國淡水蝦類中的主要優勢物種，加之其肉味鮮美、風味獨特、具有豐富的營養價值，深受廣大消費者的喜愛[1-2]。隨著人們生活水平的提高，對蝦肉的消費需求以由“量”轉變到“質”，但針對克氏原螯蝦不同生長階段肉質的相關研究較少，且目前克氏原螯蝦養殖在市場需求、加工現狀等因素的影響下[3]，出現了優良性狀逐步丟失、規格差異大、肉質不齊和金屬沉積等一系列問題[4]。因此，本試驗通過對湖南省南縣稻田養殖的不同規格克氏原螯蝦的出肉率、肝體比以及肌肉營養成分、質構特性、肌纖維特性和相關肉質基因表達量進行測定，旨在對其營養品質進行科學評估，為今后針對不同生長階段克氏原螯蝦的科學人工養殖和專用配合飼料的開發提供參考依據，促進稻田克氏原螯蝦養殖產業的可持續健康發展。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗所用克氏原螯蝦為2020年8月采集于湖南省南縣稻蝦共作田，雌雄比例隨機，共采集1 775尾，將鮮活樣品帶回實驗室，逐一稱量體長、體重，按體重分為0～10 g(A1組)、10～20 g(A2組)、20～30 g(A3組)和30～50 g(A4組)4組，各組體長和體重參數見表1。

表1 克氏原螯蝦規格與分組

1.2 檢測指標

1.2.1 肝體比和出肉率測定

用吸水濾紙擦干克氏原螯蝦體表水分，稱取蝦全重；將試驗蝦去頭去螯，剪去附肢，用鑷子將頭胸甲和腹部甲殼打開，取肝胰腺及腹部肌肉，再用鑷子剝離剩余甲殼上的肌肉，放置濾紙上吸干表面水分，用精確度為0.01 g的電子天平稱量并記錄。

肝體比(%)=(肝胰腺重/全蝦重)×100；出肉率(%)=(腹部肌肉重/全蝦重)×100。

1.2.2 肌肉營養成分分析

水分含量采用105 ℃烘箱直接干燥法(GB 5009.3—2016)測定，粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(GB 5009.3—2016)測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB 5009.3—2016)測定，粗灰分含量采用高溫灰化法(GB 5009.3—2016)測定，樣品為混樣；分別委托青島市科創有限技術公司和北京百得維斯生物技術有限公司檢測脂肪酸、氨基酸含量，每組測定3個樣品。根據1973年聯合國糧農組織(FAO)/世界衛生組織(WHO)建議的每1 g氨基酸評分標準模式和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式，分別計算得出氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)[5]；根據公式計算動脈粥樣硬化指數(AI)和血栓形成指數(TI)，評估不同規格克氏原螯蝦肌肉脂肪酸對人類心血管疾病發生的影響；根據公式計算多烯指數(PI)，以反映不同規格克氏原螯蝦多烯不飽和脂肪酸的氧化程度。

氨基酸評價模型如下：

AAS=待測樣品中某種氨基酸含量(mg/g N)/FAO/WHO標準模式中同種氨基酸含量(mg/g N)；CS=待測樣品中某種氨基酸含量(mg/g N)/全雞蛋蛋白質中同種氨基酸含量(mg/g N)；EAAI=[100×a/A)×(100×b/B)×(100×c/C)×…(100×h/H)]1/n。

式中：n為比較的氨基酸數；a，b，c，…，h為克氏原螯蝦肌肉蛋白質中某種氨基酸含量(mg/g N)；A，B，C，…，H為全雞蛋蛋白質中同種氨基酸含量(mg/g N)。

脂肪酸評價模型如下：

AI=(C12∶0+C14∶0+C16∶0)/(∑MUFA+∑n6+∑n3)；TI=(C14∶0+C16∶0+C18∶0)/[0.5×∑MUFA+0.5×∑n6+3×∑n3+(∑n3/∑n6)]；PI=(C20∶5+C22∶6)/C16∶0。

式中：MUFA為單不飽和脂肪酸。

1.2.3 肌肉特性分析

取完整蝦仁，對蝦仁的第3腹節中央位置，利用TA.XT.Plus型物性測試儀(英國Stable Micro Systems公司)進行質地多面分析(TPA)，測定硬度、咀嚼性、內聚性、膠黏性和彈性等指標。測試參數:平底柱形探頭P/36，測前速度2 mm/s，測試和測后速度均為0.5 mm/s，應變為60%，停留間隔時間5 s。每組測定3個樣品，每個樣品重復測定3次。取蝦背部肌肉，切成3 mm3左右的小塊，于4%的多聚甲醛固定液中保存，每組隨機包埋3個樣品，每個樣品選3張切片，蘇木素-伊紅染色后使用顯微鏡觀察肌纖維組織學結構，用Image-pro plus 6.0軟件測量肌纖維直徑、根數，每張片子選6個視野，計算得出肌纖維的密度和橫截面積，肌纖維密度為測出每個視野內的肌纖維根數和該視野的面積后，換算成每平方毫米的根數。

肌纖維橫截面積(μm2)=(aa/AA+bb/BB+cc/CC+…+hh/HH)/18。

式中：aa，bb，cc，…，hh為各視野下肌纖維總橫切面積；AA，BB，CC，…，HH為各視野下肌纖維根數。

1.2.4 肉質相關基因表達特性分析

從各組隨機挑選5尾蝦，根據相關文獻[6-7]和已有小龍蝦轉錄組數據分析結果選擇4個與肉質相關的基因進行表達量測定，分別為肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)、原肌球蛋白(tropomyosin,TM)、脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein,FABP)、脂蛋白脂肪酶(liportein lipase,LPL)基因。按RNA提取試劑盒(美國Omega公司，)說明書提取蝦腹部肌肉總RNA，微量檢測儀(BioPHotometer，德國Eppendorf公司)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和純度，利用Thermo反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表2。實時熒光定量PCR反應體系為10 μL，其中包括1 μL cDNA，5 μL SYBR Green Ⅰ熒光染料(Vazyme)，0.4 μL 10 μmol/L目的基因的上游引物，0.4 μL 10 μmol/L目的基因的下游引物，3.2 μL ddH2O。反應程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 40 s；40個循環，所有樣品均設置3個重復，以18S rRNA[8]和β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，運用2-△△Ct法計算相關基因的表達量。

表2 用于克氏原螯蝦實時熒光定量PCR分析的引物

1.3 數據處理與分析

數據用平均值±標準差(mean±SD)表示，原始數據經Excel 2019初步整理后，采用SPSS 26.0分析軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若組間差異顯著，再采用LSD法進行多重比較，以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肝體比、出肉率與肌肉營養成分分析

2.1.1 肝體比、出肉率與肌肉常規營養成分含量

由表3可知，不同規格克氏原螯蝦的肝體比相近，除了A1與A4組差異顯著(P<0.05)外，其他組間無顯著差異(P>0.05)；A1組出肉率顯著高于其他3組(P<0.05)；肌肉水分、粗蛋白質含量均以A1組為最高，且隨著規格增大均呈逐漸降低趨勢，A1與A4組差異顯著(P<0.05)；肌肉粗脂肪含量隨著規格增大呈逐漸升高趨勢，A4組最高，A3組次之，且A4和A3組均與A1組差異顯著(P<0.05)；肌肉粗灰分含量隨著規格增大均呈逐漸降低趨勢，A4和A3組差異不顯著(P>0.05)，但A1組與其他3組差異顯著(P<0.05)。

表3 克氏原螯蝦肝體比、出肉率與肌肉常規營養成分含量(干物質基礎)

2.1.2 肌肉脂肪酸組成與含量

由表4可知，在克氏原螯蝦腹肌中共檢測出20種脂肪酸，包含7種飽和脂肪酸(SFA)和13種不飽和脂肪酸(UFA)，其中單不飽和脂肪酸(MUFA)3種、多不飽和脂肪酸(PUFA)10種。飽和脂肪酸含量以A1組最高，A2組最低；單不飽和脂肪酸含量以A2組最高，A4組最低；多不飽和脂肪酸含量以A2組最高，A1組最低。在A1～A4組中，飽和脂肪酸中C18∶0含量最高，C22∶0含量最低；單不飽和脂肪酸中C18∶1n9c含量最高，C20∶1含量最低；多不飽和脂肪酸中C20∶5n3(EPA)含量最高，C18∶3n6含量最低。A2組的AI值和A3組的TI值最小，表明A2和A3組脂肪酸的不飽和度高；A4組的PI值最小，表明A4組的多不飽和脂肪酸降解及氧化程度低。

表4 克氏原螯蝦肌肉脂肪酸組成與含量(占總脂肪酸的比例)

2.1.3 肌肉氨基酸組成與含量及營養評價

由表5可知，在克氏原螯蝦腹肌中共檢測出17種氨基酸(不含色氨酸)，其中必需氨基酸7種、半必需氨基酸2種、非必需氨基酸8種。A1組的氨基酸、非必需氨基酸和鮮味氨基酸總量均高于其余3組，但差異不顯著(P>0.05)；A2組的必需氨基酸總量最高，且甲硫氨酸含量最高，顯著高于A3組(P<0.05)；除此之外，谷氨酸含量在A1～A4組中皆為最高；A2組必需氨基酸總量/氨基酸總量和必需氨基酸總量/非必需氨基酸總量的比值最大，但與其他3組差異不顯著(P>0.05)。

表5 克氏原螯蝦肌肉氨基酸組成與含量

由表6可知，4個組的克氏原螯蝦肌肉中賴氨酸的AAS和CS皆為最高。根據AAS，必需氨基酸中第一限制氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸，第二限制氨基酸為蘇氨酸；根據CS，必需氨基酸中第一限制氨基酸為纈氨酸，第二限制氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸。根據公式計算出的A1～A4組的EAAI分別為88.22、98.36、87.02、95.86，以A2組的EAAI最高。

表6 克氏原螯蝦肌肉必需氨基酸評價

2.2 肌肉特性分析

2.2.1 肌肉質構特性

由表7可知，克氏原螯蝦肌肉硬度、膠黏性、彈性和內聚性隨著規格增大而增加，A4組硬度、膠黏性、彈性、咀嚼性和內聚性均為最大，且咀嚼性與其他3組差異顯著(P<0.05)，硬度、膠黏性與A1和A2組差異顯著(P<0.05)。

表7 克氏原螯蝦肌肉質構特性

2.2.2 肌肉組織學結構

由圖1和表8可知，A3組的肌纖維直徑最大，并顯著大于A1和A2組(P<0.05)。A1組的肌纖維密度顯著大于其他3組(P<0.05)，而這3組之間則差異不顯著(P>0.05)。A3組肌纖維橫截面積最大，顯著高于A1和A2組(P<0.05)。

圖1 克氏原螯蝦肌肉組織學結構

表8 克氏原螯蝦肌纖維特性

2.3 肉質相關基因的表達特性分析

如圖2所示，MSTN基因在A2組的mRNA相對表達量最高，與其他3組差異顯著(P<0.05)，其中A4組中最低；TM基因在A4組的mRNA相對表達量最高，A3組次之，A4組顯著高于A1和A2組(P<0.05)；FABP和LPL基因在A4組的mRNA相對表達量最高，與其他3組差異顯著(P<0.05)，而A1、A2和A3組之間無顯著差異(P>0.05)。

數據柱形標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 營養品質評價及分析

常規營養成分主要包括粗蛋白質、水分、粗脂肪和粗灰分，其含量對蝦類品質評價起著重要作用，但主要通過粗蛋白質和粗脂肪含量來反映。本試驗中，A1組克氏原螯蝦的出肉率以及肌肉水分、粗蛋白質和粗灰分含量均為最高，而粗脂肪含量顯著低于A4組，但高于南美白對蝦(2.48%)[9]和斑節對蝦(3.85%)[10]。影響蝦體營養成分的因素很多，除物種差異外，還有蝦的生理狀況、蝦的大小、捕獲季節、飼料種類等，從出肉率和肌肉粗蛋白質含量考慮，小規格克氏原螯蝦更具有營養。

根據《中國居民膳食營養素參考攝入量速查手冊》，人體理想的膳食脂肪酸構成比例為飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=1∶1∶1[11]，此次測得的克氏原螯蝦腹部肌肉中多不飽和脂肪酸含量相對較低。試驗結果顯示，A1組飽和脂肪酸含量最高，A2組單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量皆為最高，多不飽和脂肪酸中EPA含量最高。多不飽和脂肪酸不僅具有營養和保健功能，而且可以在一定程度上增加蝦的香味和多汁性。本研究結果表明，克氏原螯蝦腹部肌肉中含有豐富的脂肪酸，在規格較小的克氏原螯蝦(A1和A2組)中尤為突出。根據FAO/WHO模式，必需氨基酸總量/氨基酸總量的比值在40%左右，必需氨基酸/非必需氨基酸的比值在60%以上的為質量較好的蛋白質，本研究結果顯示克氏原螯蝦的蛋白質營養價值滿足FAO/WHO對理想蛋白質源的評價標準。AAS和CS從不同的角度反映了蛋白質構成和利用率的關系，在A1～A4組中AAS和CS最高的均為賴氨酸，超過FAO/WHO模式。肉質食物的鮮美程度主要取決于食物中呈鮮味的谷氨酸和天門冬氨酸以及呈甘味的甘氨酸和丙氨酸含量[12]，其中，谷氨酸是鮮味最強的氨基酸，4組克氏原螯蝦肌肉中谷氨酸含量豐富，且A1組的谷氨酸含量最高，說明克氏原螯蝦肉質鮮美。

3.2 肌肉特性分析

出肉率是衡量魚、蝦等水產動物品質和生產性能的重要指標之一，本試驗測得同一時期克氏原螯蝦腹部肌肉的出肉率隨著蝦規格增大而逐漸降低，其中規格最小的A1組蝦的出肉率顯著高于其他規格蝦。本次試驗測得的稻蝦共作模式下的克氏原螯蝦的出肉率低于唐黎等[13]測得的湄潭地區稻田養殖的克氏原螯蝦(18.40%)和田娟等[14]測得的洞庭湖區野生克氏原螯蝦(20.21%)，這可能與此次所采蝦為秋季蝦有關，姚根娣等[15]研究得出秋季大小蝦整體的出肉率低于春季和夏季，且容易受生長時期、產地等影響。此外，本次試驗測得的克氏原螯蝦的出肉率還低于澳洲淡水龍蝦(17.97%)[16]和凡納濱對蝦(52.2%)[17]，表明克氏原螯蝦的出肉率較其他經濟蝦類偏低。TPA是目前用于評價水產品肉質最廣泛的方法之一[18]，包括硬度、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性等[19-20]；研究表明，隨著動物規格增加，肌纖維會增大增粗，從而硬度增大，且一定范圍內的脂肪含量的增加也會引起膠黏性增大[21]，本試驗中，A4組的肌肉硬度、膠黏性、彈性、咀嚼性和內聚性均最大，且咀嚼性與其他3組差異顯著，硬度和膠黏性與規格在20 g以下的A1和A2組差異顯著；A3組肌肉咀嚼性小于A1和A2組，可能是由于動物肌纖維密度大，肌肉間填充物多，并且咀嚼性作為一個綜合性指標，其結果受到多種因素影響[22]。一般認為，肉的硬度、內聚性和彈性越高，肉質口感越好[23-24]，因此，A4組克氏原螯蝦在口感上總體更優。

肌肉的基本組成單位是肌纖維[25]，肌纖維特性有肌纖維直徑、密度、橫截面積等。本試驗統計分析了4組不同規格克氏原螯蝦的肌纖維組織學特性，結果顯示，A3組的肌纖維直徑最大，且顯著大于A1和A2組；A1組的肌纖維密度顯著高于其他3組，而后3組之間肌纖維密度差異不顯著；A3組肌纖維橫截面積最大，顯著高于A1和A2組。大多數研究認為，肌纖維直徑是衡量肌纖維粗細的指標，肌纖維越細則肉品質越好；肌纖維密度越大則肉質越細膩[26-27]，肌纖維的密度與直徑呈負相關。本試驗中測得A1組克氏原螯蝦的肌纖維直徑最小，肌纖維密度最大，與其他3組相比肉質更細嫩。

3.3 肉質相關基因表達特性分析

MSTN是脊椎動物骨骼肌發生調控中已發現的重要負調控因子[28]，MSTN基因缺失突變能促進肌纖維的增生和肥大，增加肌肉的韌性[29]。本試驗結果顯示A4組中MSTN基因的mRNA相對表達量最低，與A2組差異顯著，提示A4組肌肉韌性更強，口感更佳。TM可以通過形成大分子作為肉味增強劑的前體，明顯地提高肉味[30]，在本試驗中TM基因在A3和A4組中的mRNA相對表達量顯著高于A1和A2組，提示規格大的蝦在肉味上要更優；FABP和LPL都參與脂質的分解代謝過程[31-32]，FABP家族能夠促進細胞攝取脂肪酸，防止脂肪酸在細胞內的堆積。本試驗中，FABP基因在A4組中的mRNA相對表達量最高，顯著高于其他3組，而其他3組間無顯著差異。有研究報道，FABP與碳鏈較短的脂肪酸如棕櫚酸、油酸親和力較高，上述脂肪酸皆在A1組含量最高，且A1組中總脂肪酸含量最高，這與FABP基因表達規律不符，可能是由于總脂肪酸含量在不同規格克氏原螯蝦中差異不大，且可能只有在線粒體氧化受阻或采用了難以代謝的脂肪酸類似物的情況下才會有FABP含量的提升[33]，脂肪酸含量高不一定會提升FABP基因的mRNA相對表達量。LPL是脂質分解代謝過程中關鍵的限速酶，與肌肉中水分含量呈負相關，與肌內脂肪含量呈正相關[34-35]，本試驗所得結果與此相符。本試驗結果顯示，A4組中LPL基因的mRNA相對表達量顯著高于其他3組，且水分含量隨著克氏原螯蝦規格增大而減少，而A4組粗脂肪含量顯著高于其他3組。此外，FABP和LPL這類脂肪沉積相關基因可以調控肌內脂肪含量[36]，肌內脂肪含量與肉的多汁性和風味呈正相關[37-38]，與肉的吞咽咀嚼次數和酸澀度呈負相關關系[39]，提示A4組在多汁性和口感風味上更優。

4 結 論

綜上所述，稻蝦共作模式下的克氏原螯蝦具有豐富的營養價值，富含油酸等多種人體必需脂肪酸，且氨基酸組成合理，因含有較多的呈味氨基酸和不飽和脂肪酸，使克氏原螯蝦具有良好的風味和一定的保健作用；此外，從出肉率以及肌肉粗蛋白質、脂肪酸總量和氨基酸總量考慮，規格小的0～10 g克氏原螯蝦在營養價值上較高；但從肌肉質構特性和4個肉質相關基因表達結果考慮，規格大的30～50 g克氏原螯蝦在風味口感上更優。