呼倫貝爾草原不同利用方式對土壤微生物群落結構的影響

曲 艷， 宋 倩， 楊合龍， 趙 坤， 趙 敏， 劉玉玲， 王德平， 戎郁萍*

(1.中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193； 2.中國草學會， 北京 100193;3.包頭市園林綠化事業發展中心， 內蒙古 包頭 014030)

土壤微生物數量龐大，種類繁多，是土壤生物的重要組成部分[1]。土壤微生物占有機質比例較小，但直接或間接參與幾乎所有的土壤過程[2]。土壤微生物群落組成、結構及功能發生微小的變化，表征土壤生態系統環境的變化[3-4]。

放牧和割草是草地資源的主要利用方式，通過移除植物地上部分，改變草地植物群落及其生長環境，影響土壤微生物群落。此外，草地放牧還通過家畜排泄物的返還以及踐踏作用，直接改變土壤微生物生存環境，進而影響土壤微生物群落[5]。長期不合理或過度利用使草地植被退化，土壤環境惡化[6]，影響土壤微生物群落組成及功能。關于草地利用方式對土壤微生物的影響是近年的研究熱點之一，李玉潔等研究表明，刈割處理下內蒙古呼倫貝爾草原的土壤微生物磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acids，PLFA)總量顯著高于圍封與放牧草地，且刈割明顯提高了土壤細菌含量，但對真菌含量無顯著影響[7]；邵玉琴等[8]研究發現土壤微生物數量隨割草頻率的增加而降低，但長期圍封降低微生物在土壤養分轉化過程中的作用；張立朝指出叢枝菌根真菌在羊草被刈割后的補償生長中發揮著重要作用[9]。近些年關于不同利用方式對呼倫貝為草原影響的研究雖較多，但尚不完善。

本文通過對內蒙古呼倫貝爾草原在封育、割草、連續放牧、不同時間休牧處理下土壤微生物群落的研究，系統地探討土壤微生物各類群組成及比值對草地利用方式的響應特征，厘清不同的草地利用方式下土壤微生物群落結構的變化規律及關鍵土壤環境驅動因子，準確評估土壤生態系統動態變化過程，對呼倫貝爾地區合理利用草地資源具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗區位于內蒙古呼倫貝爾市陳巴爾虎旗中國農業大學草地農業生態系統試驗站(49°20′～49°26′ N，119°55′～120°09′ E，海拔628～649 m)；屬半干旱大陸性季風氣候，年均氣溫—1.2℃，年均降水量約355 mm，多集中在7—8月份；土壤類型為黑鈣土或暗栗鈣土，土壤(0～10 cm)有機碳含量為36.7 g·kg-1，全氮含量為3.7 g·kg-1，全磷含量為0.5 g·kg-1[10]。該地草地類型為溫性草甸草原，建群種為羊草(Leymuschinensis)，主要植物種包括：貝加爾針茅(Stipabaicalensis)、無芒雀麥(Bromusinermis)、草地早熟禾(Poapratensis)、糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)等。

2016—2019年，設圍封、割草、連續放牧，生長季早期休牧、中期休牧及晚期休牧6個草地利用方式處理，每個處理6次重復，采用拉丁方試驗設計，共36個小區。每小區面積20 m2(4 m×5 m)，小區間設2 m的隔離帶。草地圍封處理(EN)全年不利用；割草地處理(CP)每年8月中旬刈割，留茬高度8 cm；放牧樣地采用模擬放牧處理，留茬高度6 cm，其中連續放牧處理(CG)每年6月中旬—9月中旬連續利用；生長季早期休牧處理(GR1)于每年6月中旬—7月中旬不放牧；生長季中期休牧處理(GR2)每年7月中旬—8月中旬不放牧；生長季晚期休牧處理(GR3)每年8月中旬—9月中旬不放牧。放牧小區除進行地上部分的留茬處理外，還進行踐踏和撒施糞便處理，體重約55 kg的成年人穿釘有羊蹄的鞋子在小區內走動，直至均勻踏遍，每次走動可在土壤表面施加約92 kPa的壓力，符合羊在實際踐踏中產生的壓強值[11]；放牧小區均撒施羊糞100 g·m-2干物質，其中連續放牧小區分3次施入，生長季不同時間休牧小區分2次施入[12]。

1.2 樣品采集與處理

2019年8月底，用內徑5 cm的土鉆在各小區四角及中間方位區域各隨機取10 cm土壤樣品，充分混合后，取出約500 g裝入自封袋，放入冰盒帶回實驗室。土壤樣品過2 mm篩子后均分2份，一份室內風干，用于土壤理化指標測定，另一份放入—80℃冰箱中保存，用于測定土壤硝態氮、銨態氮，微生物量碳、氮及土壤微生物磷脂脂肪酸含量等。

1.3 土壤指標測定

1.3.1土壤理化指標 土壤容重測定采用環刀法；土壤pH值測定采用酸度計(上海雷磁儀器廠，上海)；土壤電導率測定采用電導儀(上海雷磁儀器廠，上海)；土壤全碳和全氮含量測定采用元素分析儀(Elementar Vario EL C/N analyzer,Germany)；土壤全磷和速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定[13]；土壤銨態氮、硝態氮含量測定采用流動分析儀(AutoAnalyser 3,Seal Analytical,Norderstedt,Germany)。

1.3.2土壤微生物量碳、氮含量測定 準確稱取40 g新鮮土樣放入燒杯中，調節土壤含水量(田間持水量的40%)后放入底部有少量水的保鮮盒中密封，于25℃下預培養7 d。每個預處理后的樣品取20 g，均分為2份，一份在真空干燥器中用無水三氯甲烷熏蒸處理，一份為不熏蒸的對照樣品。兩份樣品均加40 ml的K2SO4溶液(0.5 mol·L-1)，振蕩過濾后，用總有機碳氮分析儀(Multi N/C 3100，Analyticjena，Germany)測定濾液中的有機碳、氮的含量[14]。

1.3.3土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的測定與分析 參考孫建[15]的方法，采用Agilent 6890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)與微生物辨別軟件(MIDI Inc.，Newark，NJ)分析磷脂脂肪酸種類。含量以PLFA 19∶0作為內標來進行定量計算，其公式如下：

式中，A為19∶0的峰值，B為目標PLFA的峰值。總微生物生物量用各PLFA含量加和表示。

根據已發表的文獻中特定磷酸脂肪酸(PLFA)標記[16]，對土壤微生物群落類群進行表征。其中將14∶00，15∶00，16∶00，17∶00，18∶1ω7c，18∶00，20∶00表征為一般性細菌；13∶0 iso，14∶0 iso，15∶0anteiso，15∶0 iso，16∶0 iso，17∶0 iso，17∶0 anteiso，18∶0 iso表征為革蘭氏陽性菌；6∶1ω9c，16∶1ω7c，17∶0 cycloω7c，18∶1ω5c，19∶0 cycloω7c表征為革蘭氏陰性菌；18∶3ω6c，18∶2ω6c，18∶1ω9c表征為真菌；16∶1ω5表征為菌根真菌；16∶0 10-methyl，20∶0 10-methyl表征為放線菌。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019進行原始數據整合，利用SAS 9.4軟件對不同草地利用方式間的土壤理化性質與各類群土壤微生物含量作單因素方差分析(One-way ANOVA)，差異顯著性水平為P<0.05，并借助Canoco 5軟件對土壤理化性質與土壤微生物群落結構進行RDA冗余分析。利用Sigmaplot14.0將數據可視化處理，采用箱式圖展示土壤微生物量碳、氮數據位置及分散等信息。數據均以平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 草地不同利用方式下土壤理化性質分析

草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤理化性質的影響不同(表1)。土壤pH值、土壤容重和全磷含量在各個草地利用方式下均無顯著性差異。而CG，GR2，GR3處理下土壤電導率顯著高于CP處理(P<0.05)，分別提高了17.69%，10.47%，19.79%。土壤全碳和全氮含量在各處理下的變化趨勢一致，均在CG處理下達到最高值，顯著高于CP處理，且與其他處理無顯著差異。EN處理下的土壤有效氮和速效磷含量均最高，其中土壤硝態氮含量較CP，GR處理顯著升高，并分別提高了58.55%，40.57%，28.24%，23.28%；土壤銨態氮含量顯著高于CG，GR2處理下，分別提高了26.41%，23.73%；而土壤速效磷含量則顯著高于CP處理，提高了39.95%。

表1 草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤理化性質的影響Table 1 The influence of grassland utilization on the physical and chemical properties of Hulunbuir grassland soil

2.2 草地不同利用方式對土壤微生物量碳、氮的影響

不同的草地利用方式下(EN，CP，CG)土壤微生物量碳、氮含量均表現為CP>CG>EN；隨著生長季休牧時期的延后，土壤微生物量碳含量呈先升高后降低的趨勢，而土壤微生物量氮含量卻呈逐漸下降的趨勢(圖1)。草地利用方式對土壤微生物量碳/氮的影響無顯著差異(圖2)。

圖1 不同草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤微生物量碳、氮含量的影響Fig.1 The effect of different grassland utilization methods on soil microbial biomass carbon and nitrogen content in Hulunbuir grassland

圖2 不同草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤微生物量碳/氮比值的影響Fig.2 The influence of different grassland utilization methods on the soil microbial biomass carbon/nitrogen ratio in Hulunbuir grassland

2.3 草地不同利用方式對土壤微生物群落結構的影響

土壤微生物PLFA總濃度及各類群濃度在不同的草地利用方式下存在一定的差異(表2)。CP處理下微生物PLFA總濃度低于其他處理，且顯著低于GR3處理(P<0.05)，降低37.60%，休牧處理(GR1，GR2，GR3)下PLFA總濃度均高于EN，CP，CG處理，且隨著休牧時間的推后，PLFA總濃度呈升高趨勢；各微生物類群含量與PLFA總量在各處理下變化情況大體一致，但值得一提的是，真菌與革蘭氏陰性菌PLFA含量在休牧放牧下有所改變，真菌PLFA含量在GR2處理下最低，而革蘭氏陰性菌則在GR2處理下濃度最高。

表2 不同草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤微生物菌群PLFA含量的影響Table 2 Effects of different grassland utilization methods on the PLFA content of soil microbial flora in Hulunbuir grassland

土壤微生物PLFA比值變化(表3)結果顯示，細菌/真菌PLFA濃度比在各處理下均無顯著性差異，GR2與GR3處理下變異系數同時達到最大，CP處理下最小；對革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌(G+/G-)PLFA濃度比而言，CG處理下比值最高，顯著高于GR2處理(P<0.05)，但與其他處理差異不顯著。EN，CP與CG處理下G+/G-整體上高于休牧處理(GR1，GR2，GR3)。從比值變異程度來看，CG處理下的G+/G-比值變異系數最大，而GR2處理最小，與細菌/真菌相反。

表3 草地利用方式對呼倫貝爾草原土壤微生物PLFA比值的影響Table 3 The influence of grassland utilization on the ratio of soil microbial PLFA in Hulunbuir grassland

2.4 土壤微生物群落結構與土壤理化性質的關系

對土壤理化性質指標和微生物群落結構間的關系進行冗余分析(圖3)，結果表明，土壤pH值、電導率、硝態氮和銨態氮含量等變量可以解釋69.2%的微生物群落變異，擬合效果較可靠。其中細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、放線菌及總磷酸脂肪酸含量與土壤電導率、銨態氮含量呈顯著的正相關關系，與土壤pH值呈顯著負相關關系，且真菌與硝態氮含量具有顯著的負相關關系；細菌/真菌與土壤硝態氮含量、電導率呈顯著的正相關關系，與土壤pH值呈負相關關系，與土壤銨態氮含量幾乎無關；革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌與土壤硝態氮含量、pH值呈正相關關系，與電導率和銨態氮含量呈負相關關系。此外細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、放線菌及總磷酸脂肪酸含量的正相關性極強；土壤電導率與銨態氮、硝態氮含量呈正相關關系，與土壤pH值呈負相關關系，而銨態氮和硝態氮含量卻呈負相關關系。

圖3 呼倫貝爾草原區土壤微生物群落結構與土壤理化性質的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil microbial community structure and soil physical and chemical properties in Hulunbuir grassland area注：銨態氮；硝態氮；pH，pH值；Ec，電導率；bacteria，細菌；G+，革蘭氏陽性菌；G-，革蘭氏陰性菌；fungi，真菌；actinomycetes，放線菌；Total PLFA，總磷脂脂肪酸；bacteria/ fungi，細菌/真菌；G+/G-，革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌Note:N nitrogen；pH,pH value；Ec,conductivity；bacteria,bacteria;G+,Gram-positive bacteria；G-,Gram-negative bacteria；Fungi,fungi;actinomycetes,actinomycetes;Total PLFA,total phospholipid fatty acids；Bacteria/fungi，bacteria/ fungi；G+/G-,Gram-positive bacteria/Gram-negative bacteria

3 討論

土壤微生物對土壤元素和養分的循環及轉化具有關鍵的作用。此外，土壤微生物作為周圍環境變化的指示因子，能夠敏感且快速做出甄別性反應[7,17]。草地利用方式的差異通常會導致土壤環境因子(包括土壤物理及化學特征)出現強烈變化，進而影響土壤微生物群落的數量及結構[18-20]。對圍欄禁牧、連續放牧和休牧(早期休牧、中期休牧、晚期休牧)3種草地利用方式下土壤的理化性質指標及土壤微生物群落結構的變化進行研究，發現禁牧處理下土壤總PLFA量最高，可見禁牧有助于土壤肥力的恢復，斯貴才等[21]也曾指出圍封利于土壤微生物生長繁衍。在放牧形式下，隨著休牧時間推后，各類群PLFA含量總和呈增高趨勢，這可能與植物體生長發育程度有關，當植物進入生長發育的成熟階段，對土壤養分的需求更大，并促進土壤中微生物的活動，使土壤微生物PLFA含量升高；從微生物類群比值角度看，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對養分的吸收能力強，更能適應不良的環境條件[22]，二者比值可反映土壤底物即有機質供應水平，底物養分有機氮與其比值(G+/G-)呈負向關系，即前者越多，比值便越小，進而對微生物的營養脅迫越高[23]；表3結果顯示連續放牧(CG)下G+/G-最高，說明連續放牧下草地土壤底物供給碳、氮等養分的能力最低，造成了微生物的營養脅迫。當草地連續放牧利用時，地上、地下生物量均降低，凋落物量減少，養分循環減緩[24]。而中期休牧處理下的G+/G-最低，可見生長季中期休牧使微生物得到很好的營養供給，有助于整個生態系統的可持續運行。此外細菌/真菌比值可表征兩個微生物類群的相對豐度及生態系統穩定性，比值越低說明生態系統的緩沖性和抗干擾能力越強[23]，表3結果顯示各草地利用方式下細菌/真菌均無顯著性差異，表明不同草地利用方式對生態系統的緩沖性能和抗干擾能力無明顯影響。但這僅為單一特征的指向，不足以說明生態系統復雜的功能特性，因此關于生態系統的抵抗性和緩沖性對草地利用方式的響應機制還需更多的指標進行全面的研究。

土壤微生物群落的數量和組成等特征可快速的反映土壤質量情況[25-26]，土壤理化性質的改變便成為了致使微生物代謝特征發生變化的關鍵原因[27]。草地利用方式的不同，土壤物理性狀及養分含量會出現較大的差異[28]，進一步土壤微生物結構功能受到顯著影響[29]。根據對土壤理化性質指標及土壤微生物群落組成結構進行約束排序，權衡模型的可靠性，僅篩選出土壤電導率、pH值、銨態氮和硝態氮4種土壤環境因子來分析與微生物間的相互關系，可見土壤環境因子雖眾多，但不一定均可直接作用于微生物。冗余分析(RDA)結果顯示總磷酸脂肪酸及各微生物類群均與土壤電導率和銨態氮呈極強的正相關關系，卻與pH值呈極強的負相關關系。土壤電導率的升高可在一定程度上加強土壤養分的轉化，改變其存在狀態及有效性，且土壤底物氮的數量對于微生物數量及功能存在直接的影響。偏堿性土壤會為微生物各類群提供更利的生存環境，這與馬大龍等[30]在大興安嶺多年凍土區及韓世忠等[31]在中亞熱帶地區米櫧天然林對土壤微生物進行的研究結果相悖，可見氣候因子中的氣溫及降水等對此過程產生的復雜調控是不可忽視的。土壤pH值、電導率不僅對微生物群落數量、組成及結構存在一定的影響作用，還積極調控著微生物功能走向，由此推斷土壤鹽堿度與pH值可作為呼倫貝爾地區草原區域微生物的關鍵預測指標。

4 結論

通過對土壤微生物群落結構對草地利用方式的響應研究，發現休牧處理下土壤微生物數量高于其他的草地利用方式，且休牧期推后更利于土壤微生物的生長繁殖；此外生長季中期休牧會提高土壤底物供給微生物養分的能力；冗余分析顯示電導率高且偏堿性土壤會為微生物提供更有利的生存環境。因此，將土壤鹽堿度和pH值作為呼倫貝爾草原區域微生物群落結構及功能的關鍵預測指標。