琥珀酸黃桿菌促生機(jī)理及其對(duì)多年生黑麥草生長(zhǎng)和抗逆性的生理調(diào)控作用

張新飛， 佘木子， 李晗玉， 敬 松， 姜惠娜， 高 浩， 朱延曉， 付娟娟

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

植物根際促生細(xì)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是生存于植物根際范圍內(nèi)的一類有益細(xì)菌的統(tǒng)稱。近年來許多研究表明，它不僅可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量，而且還能提高植物的干旱、鹽、重金屬等多種非生物脅迫抗性，提高植物在各種環(huán)境脅迫中的適應(yīng)能力[1-2]。然而，目前從根際土壤中篩選植物促生菌，并應(yīng)用于草坪草抗逆性的研究鮮有報(bào)道。

多年生黑麥草(Loliumperenne)是城市綠化以及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪建植中常用的冷季型草種，因其具有草坪質(zhì)量?jī)?yōu)、成坪快和綠期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，常常作為草坪建植的先鋒草種。同時(shí)，由于其產(chǎn)量高、飼用價(jià)值高，也是重要的牧草植物[3-4]。然而，多年生黑麥草的耐旱、耐寒和耐鹽性均較差，干旱、低溫和鹽脅迫均會(huì)對(duì)多年生黑麥草的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。研究如何提高多年生黑麥草的耐旱、耐寒和耐鹽性將有利于增加其在草坪和農(nóng)牧業(yè)中的應(yīng)用。

本研究基于前期16S rRNA測(cè)序結(jié)果，從麥冬(Ophiopogonjaponicus)根際土中分離篩選到琥珀酸黃桿菌(Flavobacteriumsuccinicans)DSM4002菌株[5]。然而，關(guān)于琥珀酸黃桿菌調(diào)控草坪草干旱、低溫和鹽脅迫應(yīng)答的機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)分析了琥珀酸黃桿菌的生物學(xué)特性，采用盆栽法研究根際接種琥珀酸黃桿菌對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)及干旱、低溫和鹽脅迫的影響，為進(jìn)一步解析琥珀酸黃桿菌與植物互作應(yīng)答干旱、低溫和鹽脅迫的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為今后利用PGPR提高多年生黑麥草及其他草坪草在非生物脅迫下的適應(yīng)能力提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的琥珀酸黃桿菌株(DSM4002)分離自西北農(nóng)林科技大學(xué)麥冬草坪根際土[5]，菌種現(xiàn)保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。供試的多年生黑麥草種子購(gòu)買于北京正道草業(yè)有限公司，品種為‘博士’(‘ph.D’)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1琥珀酸黃桿菌的特性研究 菌株分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)能力測(cè)定采用Salkowski比色液法[6]；溶磷能力采用鉬銻抗比色法培養(yǎng)2 d后測(cè)定[7]；鐵載體能力測(cè)定采用嗜鐵素(Chrome azurol sulphonate,CAS)檢測(cè)液法[8]。

1.2.2種子消毒與幼苗培養(yǎng) 多年生黑麥草種子經(jīng)1% NaClO溶液消毒5 min后，無菌水清洗3次，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗條件下萌發(fā)至2 cm左右時(shí)，選取健康的幼苗轉(zhuǎn)移至裝有已滅菌的石英砂的10 cm塑料盆中，每盆10株，置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光通量密度為12 000 lx，濕度65%，光期/暗期為16 h/8 h(25℃/20℃)。每3 d澆一次滅菌的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.3多年生黑麥草接種處理 參考本實(shí)驗(yàn)室前期方法培養(yǎng)并制備琥珀酸黃桿菌(DSM4002)菌懸液[9]。幼苗培養(yǎng)21 d后，每盆取10 mL DSM4002菌懸液注射到多年生黑麥草根系周圍，每隔3 d接種一次，共接種3次。

1.2.4根際定殖試驗(yàn) 采用水培法培養(yǎng)多年生黑麥草幼苗，取1 mL用綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記的DSM4002菌懸液注射到生長(zhǎng)14 d的多年生黑麥草幼苗根系上，水平置于濾紙上孵育1 h后，重新將根系放回水培盒中，每隔1 d接種一次，共接種3次，接種1周后，用體視熒光顯微鏡觀察熒光。

1.2.5多年生黑麥草干旱、低溫和鹽處理 多年生黑麥草幼苗接種20 d后分別進(jìn)行低溫(4℃)處理3 d和7 d；干旱脅迫參考Tan等[10]的方法，采用稱重法每天補(bǔ)充相應(yīng)水分來維持對(duì)照土壤水分含量維持(2.2±1.0) g水/g干土，干旱處理維持土壤含水量為(0.7±0.3 g)水/g干土，處理7 d和14 d；鹽脅迫參考Li等[11]方法用150 mM NaCl處理5 d和10 d，以不進(jìn)行脅迫處理為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理后收集葉片和根系樣品，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.6多年生黑麥草相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 選取各個(gè)處理的6株植株，分別測(cè)量株高及根長(zhǎng)，并稱量地上部和根的鮮重；植株置于烘箱中105℃殺青15 min，80℃烘干至恒重，稱量地上部和根的干重。采用電導(dǎo)儀(上海雷磁DDS-307)測(cè)定葉片的相對(duì)電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定葉片中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量[12]；采用氮藍(lán)四唑(Nitroblue tetrazo-lium，NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性[13]；愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性[14]；紫外分光光度法測(cè)定過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性[15]；參考Yoshiyuki和Kozi[16]的方法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)活性；采用磺基水楊酸法和蒽酮比色法測(cè)定樣品脯氨酸含量和可溶性總糖含量。

1998年1月1日起試行的《高等學(xué)校會(huì)計(jì)制度（試行）》文件明確規(guī)定，高校會(huì)計(jì)核算一般采用收付實(shí)現(xiàn)制，對(duì)固定資產(chǎn)不計(jì)提折舊，僅反映固定資產(chǎn)原值的增減變動(dòng)情況。這種不計(jì)提折舊的管理制度，無法真實(shí)反映固定資產(chǎn)的實(shí)際價(jià)值，也不能真實(shí)體現(xiàn)高校教育成本，在實(shí)際操作過程中顯示出了諸多弊端，如固定資產(chǎn)賬面價(jià)值與實(shí)際價(jià)格不符、無法補(bǔ)償固定資產(chǎn)的損耗等。2013年1月1日起施行新的《高等學(xué)校會(huì)計(jì)制度》（財(cái)教〔2012〕488號(hào)），該文件明確規(guī)定，要求高等學(xué)校按月計(jì)提固定資產(chǎn)折舊，并做了相應(yīng)的規(guī)定，這為固定資產(chǎn)折舊工作提供了文件依據(jù)，固定資產(chǎn)的會(huì)計(jì)核算也必須根據(jù)組織環(huán)境的變化而改變。

1.2.7數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行二因素方差分析，若有顯著差異，應(yīng)用Duncan’s法對(duì)平均值進(jìn)行多重比較(P<0.05)。使用Excel 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株促生特性分析

利用比色法對(duì)供試菌株分泌IAA及溶無機(jī)磷的能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，琥珀酸黃桿菌具有分泌IAA及溶無機(jī)磷的能力，在含0.5 mg·mL-1色氨酸的培養(yǎng)基產(chǎn)IAA量為14.12 μg·mL-1，且溶磷量達(dá)201.60 μg·mL-1(表1)。

采用CAS平板檢測(cè)法對(duì)琥珀酸黃桿菌產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行了定性與定量檢測(cè)。菌落周圍能夠形成橙色光圈，且對(duì)菌株的鐵載體暈圈直徑D和菌落直徑d的測(cè)定結(jié)果顯示，3次重復(fù)R值均大于1.5，說明琥珀酸黃桿菌產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)。定量分析顯示，鐵載體濃度與A/Ar值呈線性關(guān)系，該菌株產(chǎn)鐵載體等級(jí)為“+++++”，屬于高產(chǎn)鐵載體菌株(表1)。

表1 菌株IAA分泌、溶無機(jī)磷和產(chǎn)鐵載體能力Table 1 Concentration of IAA secrete from the strain and the ability of dissolving inorganic phosphorus and crrier capacity of iron production

2.2 菌株抗生素抗性及根系定殖情況分析

菌株DSM4002在含壯觀霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、鏈霉素和四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基均能夠正常生長(zhǎng)，而在含有氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，表明DSM4002對(duì)氯霉素敏感。將DSM4002在含不同濃度氯霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株生長(zhǎng)情況與液體培養(yǎng)基中結(jié)果一致(圖1A)，驗(yàn)證了DSM4002對(duì)卡那霉素具有抗性，對(duì)氯霉素敏感的結(jié)果。在熒光顯微鏡下觀察到根系有綠色熒光，說明菌株定殖成功(圖1B)。

圖1 DSM4002菌株抗性分析(A)和定殖情況(B)Fig.1 Antibiotic resistance (A) and root colonization (B) of DSM4002

2.3 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對(duì)多年生黑麥草生長(zhǎng)的影響

干旱、低溫和鹽脅迫均抑制多年生黑麥草的生長(zhǎng)，而接種DSM4002能夠促進(jìn)脅迫0 d即正常生長(zhǎng)(CK)、低溫、干旱和鹽脅迫下多年生黑麥草的生長(zhǎng)(圖2A，B)。與未接種DSM4002處理相比，接種DSM4002導(dǎo)致干旱14 d、低溫3 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草株高分別提高了37.84%，90.88%，33.41%和45.83%(P< 0.05)；接種DSM4002也促進(jìn)干旱14 d、鹽10 d脅迫下多年生黑麥草根的生長(zhǎng)，分別較未接種處理提高了33.88%，33.80%(P<0.05)。

與未接種的植株相比，接種DSM4002導(dǎo)致CK、干旱7 d、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草地上部鮮重分別提高了57.84%，25.58%，141.38%，103.08%，78.85%，39.81%，164.91%；此外，在CK、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d和鹽10 d處理下，接種DSM4002使得根鮮重分別提高了27.27%，86.96%，48.28%，111.11%和91.67%(P< 0.05)(圖2C，D)；地上和根系干重也表現(xiàn)出類似的響應(yīng)(P<0.05)(圖2E，F(xiàn))。

2.4 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對(duì)多年生黑麥草細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，與CK相比，干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理下多年生黑麥草葉片電導(dǎo)率顯著升高，分別增加了171.93%，126.00%，226.03%，66.00%和118.01%；而接種DSM4002處理能夠顯著降低電導(dǎo)率，分別降低了76.32%，54.82%，59.79%，42.25%和45.03%(P<0.05)。而且，接種DSM4002也能夠顯著降低干旱7 d、干旱14 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理中多年生黑麥草葉片中丙二醛積累，與未接種相比分別降低了16.63%，39.76%，27.38%，35.92%，21.25%和31.37%(P<0.05)。

圖3 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對(duì)多年生黑麥草葉片中相對(duì)電導(dǎo)率(A)和丙二醛(B)的影響Fig.3 Effects of inoculation with DSM4002 on relative electric conductance (A) and MDA content (B) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

2.5 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對(duì)多年生黑麥草抗氧化酶活性的影響

圖4 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對(duì)多年生黑麥草SOD(A)，CAT(B)，POD(C)，APX(D)和GR(E)活性的影響Fig.4 Effects of inoculation with DSM4002 on the activities of SOD (A),CAT (B),POD (C),APX (D)and GR (E) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

2.6 干旱、低溫和鹽脅迫下接種DSM4002對(duì)多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)能力的影響

接種DSM4002能夠提高對(duì)照及干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中可溶性糖和脯氨酸的積累(圖5)。與未接種相比，接種DSM4002導(dǎo)致CK、干旱7 d、低溫3 d、低溫7 d、鹽5 d和鹽10 d處理中可溶性糖含量和脯氨酸含量分別提高了40.91%，152.09%，27.98%，17.44%，50.19%，17.07%和 48.23%，54.04%，45.25%，21.83%，29.93%，20.14%，而干旱14 d處理下二者含量沒有顯著變化(P<0.05)。

圖5 干旱、低溫和鹽脅迫下接種琥珀酸黃桿菌DSM4002對(duì)多年生黑麥草可溶性糖(A)和脯氨酸(B)含量的影響Fig.5 inoculation with DSM4002 on the content of soluble sugar (A) and proline(B) in the leaves of Lolium perenne under drought,cold and salt stresses

3 討論

3.1 琥珀酸黃桿菌具有多功能特性

植物根際促生菌(PGPR)的促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用與其具有分泌植物激素、溶磷、溶鐵、解鉀等能力密切相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)許多根際促生菌具有分泌IAA的能力[18]。本研究中供試菌株DSM4002的IAA產(chǎn)量為14.11 μg·mL-1，與前人的研究結(jié)果基本一致[19]。此外，一些植物促生菌能分泌有機(jī)酸，降低植物根圍土壤的pH值，將不溶性的磷轉(zhuǎn)變成可溶性的磷，使磷有效的被溶解與吸收，從而促進(jìn)植物生物量的增加[20]。本研究篩選的琥珀酸黃桿菌DSM4002菌株溶磷量為201.2 μg·mL-1，與雷海英等[21]與楊婉秋等[22]篩選出的菌株(溶磷量分別為1.908 μg·mL-1，8.91～90.27 μg·mL-1)相比，具有更強(qiáng)的溶磷能力。

鐵載體與金屬結(jié)合能夠增加可溶性金屬元素的濃度，可以促進(jìn)植物對(duì)鐵元素的吸收，也有利于緩解土壤中高濃度重金屬對(duì)植物的毒害[23]。對(duì)供試菌株DSM4002產(chǎn)鐵載體性能的測(cè)定結(jié)果表明，DSM4002菌株產(chǎn)生鐵載體相對(duì)含量的A/Ar值為0.098，比楊鴻儒[24]和張盼[25]篩選出的菌株產(chǎn)鐵載體能力更高。kadmiri等人的研究[26]與本研究結(jié)果相似，當(dāng)小麥?zhǔn)艿禁}脅迫后接種具有溶磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA的桿菌SBP-6后，與未接種的植株相比，生物量得到明顯提高。

3.2 琥珀酸黃桿菌促進(jìn)了多年生黑麥草的生長(zhǎng)

PGPR能夠通過各種機(jī)制直接或間接地提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[27]。干旱脅迫下接種巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)BOFC15顯著提高了擬南芥(Arabidopsisthaliana)的耐旱性，增加了植株地上部和根系的鮮重和干重[28]。Abdelaziz等人[29]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下接種梨形孢子菌(Piriformosporaindica)到番茄上，植株鮮重和干重分別增加了26%和33%，并緩解了鹽脅迫對(duì)植株分枝以及地上部和根系生長(zhǎng)的抑制作用。本研究結(jié)果也表明，接種琥珀酸黃桿菌不僅可以提高正常生長(zhǎng)條件下多年生黑麥草幼苗的生長(zhǎng)，還能有效緩解干旱、低溫和鹽脅迫對(duì)多年生黑麥草的生長(zhǎng)抑制作用并促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

3.3 琥珀酸黃桿菌維持了干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草質(zhì)膜的相對(duì)完整性

在正常生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞膜對(duì)于物質(zhì)具有選擇透性的能力，在植物受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞膜的完整性受到破壞[30]。植物相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量能夠反映植物的細(xì)胞膜損傷程度[31]。Han等人[32]研究表明接種解淀粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)降低了鹽脅迫下白三葉的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率。與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)接種琥珀酸黃桿菌DSM4002能夠顯著地降低干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，減輕葉片細(xì)胞膜的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱、低溫和鹽脅迫均會(huì)不同程度地改變多年生黑麥草葉片中SOD，CAT，POD，APX和GR的活性，接種DSM4002能夠進(jìn)一步提高這些抗氧化酶的活性，這表明DSM4002能夠通過激活抗氧化酶系統(tǒng)活性提高活性氧清除能力，從而維持了植物體內(nèi)的氧化還原平衡，減輕多年生黑麥草受干旱、低溫和鹽脅迫產(chǎn)生的氧化損傷，增強(qiáng)了多年生黑麥草的脅迫抗性。相似地研究也表明，在250 mM鹽脅迫下，接種根內(nèi)生真菌梨形孢子菌(Piriformosporaindica)提高了紫花苜蓿的抗氧化酶活性，與未接種處理相比，POD，SOD和CAT活性分別提高44%，40.5%和38%[33]。

3.4 琥珀酸黃桿菌增強(qiáng)了干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草的滲透調(diào)節(jié)能力

可溶性糖和脯氨酸是環(huán)境脅迫中植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于維持滲透平衡和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，清除活性氧，以提高植物的適應(yīng)能力[34]。

以前研究表明，干旱脅迫下接種PGPR菌劑BBS導(dǎo)致玉米幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著提高[35]。接種P.extremorientalisTSAU20處理使得鹽脅迫下番茄葉中脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加[36]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)接種DSM4002能夠顯著提高干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草葉片中可溶性糖和脯氨酸的含量，能夠幫助多年生黑麥草積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高抵御干旱、低溫和鹽脅迫的能力。

4 結(jié)論

琥珀酸黃桿菌菌株DSM4002促進(jìn)多年生黑麥草的生長(zhǎng)可能與其自身能夠產(chǎn)鐵載體、分泌植物激素和具有溶磷能力有關(guān)；接種DSM4002不僅能夠促進(jìn)正常生長(zhǎng)條件多年生黑麥草地上部和根系的生長(zhǎng)，而且可以提高干旱、低溫和鹽脅迫下多年生黑麥草的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力，降低相對(duì)質(zhì)膜透性和丙二醛積累量，緩解環(huán)境脅迫引起的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物的抗旱、抗寒和抗鹽能力。