汞脅迫對4個草坪草、牧草品種幼苗生長和生理的影響

杜建雄, 任尉香, 袁涓文, 黃慧瓊, 劉 杰, 肖 玉

(1.貴州財經大學公共管理學院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州師范大學外國語學院, 貴州 貴陽 550025；3.貴州師范學院生物科學學院, 貴州 貴陽 550018)

現代工業對汞的需求量逐年增加，但離子態汞的毒性較強，容易污染周邊生態環境，還能通過食物鏈富集作用危害人體健康[1]。尤其是近現代汞礦的長期大規模開發利用，使汞化合物已成為礦區周邊生態環境及農產品的主要污染源[2]。汞污染地區多以小面積更換表土、增施有機質或大量淋洗的方式來降低土壤汞濃度，這些措施取得了一定的治理效果，但仍存在成本高、費時低效或造成污染擴散的缺陷[3-4]。近年來，采用汞富集能力及耐汞脅迫能力強的植物修復汞污染土壤已成為一種新的發展方向[5]。禾本科及豆科草種發達的地下根系能有效固持土壤，在地表能形成緊密的植被覆蓋，是一類理想的水土保持植物[6]。朱劍飛等發現苜蓿(MedicagosativaL.)、黑麥草(LoliumperenneL.)等能在Cu，Pb等重金屬污染的土壤中正常生長[7]，且能將土壤中的重金屬離子富集到體內，最終可通過反復刈割，移除修剪物來減少土壤的中的重金屬含量[8]。但高濃度的汞脅迫同樣會抑制植物種子的萌發和生長，植株體內的汞積累會誘導活性氧的積累，造成組織細胞的氧化脅迫傷害[9]。如40 mg·L-1的汞脅迫顯著降低桔梗種子的發芽勢和發芽率[10]；50 μmol·L-1的汞離子嚴重抑制小麥幼苗生長，葉片葉綠素含量及根系活力顯著下降，丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和游離脯氨酸含量顯著升高[11]。因此，選擇良好汞耐受及汞富集能力的草種成為汞礦區生態修復所面臨的首要問題。杜俊楠發現紫花苜蓿、高羊茅等4種地被植物對汞污染土壤的適應能力存在較大差異，并指出4種牧草在低濃度汞脅迫下對土壤汞有良好的富集能力，但在高濃度汞脅迫下，植株脯氨酸含量和MDA含量增高，抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量下降，4種牧草對汞的富集能力均隨之減弱[12]。本研究以沙培盆栽試驗結合含汞營養液模擬不同濃度汞脅迫處理，深入探討前期汞脅迫發芽試驗篩選出的4個草坪草、牧草品種在汞脅迫下的生長和生理特性，通過模糊隸屬函數綜合評價法對4個草種耐汞性進行排序，以期為汞污染土壤植物修復和草種選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草種‘金皇后’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Golden empress’)，多花黑麥草‘盛宴’(Loliummultiflorum‘Feast’)，紫羊茅‘傳奇’(Festucarubra‘Legend’)和‘派尼’(Festucarubra‘Pernille’)的種子于2016年8月購自百綠集團，種子凈度均>98%。

1.2 沙培盆栽試驗設計

沙培盆栽試驗參照李劍峰等的方法[13]，選用過1 mm篩的清潔不含汞河沙，經HCl浸泡4 h并以去離子水浸洗3遍，121℃濕熱滅菌2 h后烘干。將參試種子在26.2 cm×18.1 cm，高7.8 cm，盛有河沙(沙面高7 cm)的網底塑料育苗盆中，每盆在沙表均勻放置100粒草種。播種并覆沙0.5 cm后，參照廖翌揚等的方法以含HgCl2營養液對4個草種的種子及幼苗進行脅迫處理[14]。分別將網底育苗盆置于盛有0，30，60，90，120 mg·L-1HgCl2的Hoagland營養液水槽中，營養液自盆底向上緩慢滲透至沙土表面，每個處理5個重復。每5 d分別以5個含不同濃度HgCl2的Hoagland營養液澆灌各處理1次，保證各處理汞脅迫濃度，處理30 d后測定幼苗相關指標。

住院醫師規范化培訓的培訓醫師的課堂授課時間緊張，由于臨床醫師的工作繁忙，對培訓醫師的理論授課時間一般是小時段集中教學，不會像在校學習的專職教師那樣大學時授課教學，所以授課時間有限，而所需要教授的內容卻非常多，很多培訓醫師想要學習和解決的問題沒有充足的時間完成。

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1.3 測定指標和方法

2.1.1出苗率 出苗率能反映種子對逆境的耐受能力[23]。15 d內4個草種的出苗率隨汞脅迫濃度升高呈下降趨勢(圖1)。汞脅迫濃度為30 mg·L-1時，4個草種的出苗率降低1.3%～1.6%，但與對照(0 mg·L-1)差異不顯著；汞濃度> 60 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘傳奇’、‘派尼’的出苗率顯著低于對照(P<0.05)，表明此時汞脅迫對各草種出苗的抑制作用明顯；當汞濃度達120 mg·L-1時，‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’和‘盛宴’的出苗率較各自對照分別下降58.7%，58.2%，57.8%和54.7%，說明高濃度汞脅迫對4個草種出苗抑制程度更高。

1.4 數據處理

2.2.2葉片PS Ⅱ原初光能轉化效率(Fv/Fm) PS Ⅱ原初光能轉化效率(Fv/Fm) 常用于度量植物葉片的光合能力，是表明光化學反應狀況的重要參數[28]。由圖2可見，隨著汞脅迫濃度的升高，‘盛宴’、‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’的Fv/Fm先緩慢降低再急劇下降；30 mg·L-1的汞脅迫濃度下，各草種幼苗的葉片的Fv/Fm較對照并無顯著差異，表明此時葉片的光合能力尚未發生明顯損傷；當汞脅迫濃度為60 mg·L-1時，‘盛宴’、‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’的Fv/Fm較對照顯著下降(P<0.05)，說明幼苗的光合能力已產生實質性損傷；當汞脅迫濃度為到120 mg·L-1時，4個草種的Fv/Fm較對照和30 mg·L-1的處理均有顯著下降(P<0.05)，表明高濃度汞脅迫嚴重影響了4個草種光合作用的正常進行。

式(1)：μxj=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，．．．，n

小麥抽穗后水分需求非常大，要做到“地皮見濕不見干”，但是澆水時要根據墑情和氣象預報情況再酌情考慮[5]。

受王水照會長的委托，由我來做會議總結。剛才聽了四位小組代表的匯報以后，我覺得我原來準備要講的許多內容都顯得多余了。我非常感謝剛才李朝軍(貴州師范大學)、鞏本棟(南京大學)、范松義(重慶師范大學)、程杰(南京師范大學)四位先生代表他們小組所作的匯報，他們四個人的發言風格不一樣，但是春蘭秋菊各有所長，匯報得都很精彩。當然也有一點點的遺憾，因為四個小組發言的都是男性學者，而我們這次會議代表中間，女性學者在數量方面三分天下占其一，所以我們希望下一次年會的小組匯報至少能推薦一至兩位女性學者上來報告，女性學者有她們天生的優勢，她們比較細致，比較縝密，報告起來會有另外一種風味。

2.1.2株高 株高能直觀反映植物的受脅迫程度[24]，隨著汞脅迫濃度的升高，各草種30 d幼苗的株高均呈下降趨勢(圖1)。30 mg·L-1汞脅迫下，‘盛宴’的株高較對照顯著降低27.4%(P<0.05)；當汞濃度達60 mg·L-1時，‘盛宴’和‘傳奇’的幼苗株高顯著下降(P<0.05)；汞脅迫濃度為90～120 mg·L-1時，各草種的幼苗株高均顯著低于對照(P<0.05)；汞濃度達120 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘傳奇’和‘派尼’的株高分別較對照下降44.7%，52.3%，53.3%和57.5%，表明4個草種幼苗的生長均受到嚴重抑制。

蘇軾于1036—1101年間在世，慶歷二年時蘇軾不到10歲，且跋中言“桑榆之末景，憂患之余生”，其作時絕非青年時期，因而他所見者絕不可能是唐十五卷本，而只能是宋十卷本。而且蘇軾是宋代的大學士，能大量閱讀政府公藏書籍，他所見者，應當就是公藏的十卷本，也即《崇文總目》所載者。這也證明了在宋十卷本《嵇康集》中，肯定有《養生論》一篇。

2 結果與分析

2.1 不同濃度汞脅迫對4個草種幼苗出苗率、株高、干重、葉面積的影響

由圖1可知，不同濃度汞脅迫對4個草種的出苗率、株高、干重、葉面積具有不同程度的影響。

出苗率從播種之日起每日觀察出苗植株并計數，以不再有新苗破土為計數終點，各處理取5個盆栽重復的平均值；沙培試驗30 d后將盆栽浸入盛水水槽，待沙基質松散后，無損取出植株，以蒸餾水沖洗3～5遍后以吸水紙吸干表面明水后，每重復盆栽各隨機取植株1株用于測定葉面積和株高，之后于烘箱110℃殺青30 min，80℃烘至恒重后測定生物量干重。株高及生物量及參照柯玉琴的方法測定[15]；葉面積參考于龍鳳等的方法測定[16]；葉片葉綠素含量參照王學奎等的方法測定[17]；葉片MDA含量以硫代巴比妥酸比色法測定[18]；另于各處理盆栽洗出的無損新鮮植株中各取整株5株，分離下葉片及根系并稱重，分別以蒽酮法及TTC法測定[19]葉片可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量及根系活力；參照王佩舒等的方法[20]，用超便攜式調制熒光分析儀(MINI-PAM-II德國WALZ)葉綠素熒光特性，葉片預先暗適應30 min后測定Fv (可變熒光)，Fm (最大熒光)，并計算Fv/Fm (葉片PS Ⅱ原初光能轉化效率)各處理盆栽以(MINI-PAM-II,德國WALZ)超便攜式調制熒光分析儀進行植株葉綠素熒光指標的測定，每處理5盆，每盆隨機測定一株作為重復(n=5，下同)。

2.1.3干重 植株生物量直觀體現植物在重金屬離子脅迫下的生長態勢[25]。由圖1可知，4個草種幼苗在30 mg·L-1，60 mg·L-1，90 mg·L-1，120 mg·L-1汞脅迫濃度下的干重均顯著低于對照(P<0.05)，且幼苗干重的降幅均隨著汞脅迫濃度的升高而增大。當汞脅迫濃度為60 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘傳奇’和‘派尼’的干重較對照分別降低73.6%，47.0%，57.0%和32.8%。表明在低濃度汞脅迫下，植物生長也明顯受抑制，干物質積累量減少；當汞脅迫濃度增大到120 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘傳奇’、‘派尼’的幼苗干重分別較對照降低80.7%，74.7%，79.5%和56.8%，表明高濃度汞脅迫嚴重抑制各草種正常生長。

我的爸爸還是一個幽默搞笑的人。有一次，他無意間撈到了一只青蛙，“看！這只青……”他剛說到這里，那只青蛙就回頭看了看他，“撲通”一聲跳進了水里，弄得他滿臉都是泥水，就像是一只“大青蛙”。我看了一眼被泥水濺成“大花臉”的爸爸，“撲哧”一聲笑了出來。

2.2 不同濃度汞脅迫對4個草種幼苗葉綠素含量、PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)的影響

由圖2可知，不同濃度汞脅迫對4個草種的葉綠素含量、PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm) 具有不同程度的影響。

2.2.1葉綠素含量 葉綠素是植株進行光合作用的基礎[27]。由圖2可知，隨著汞脅迫濃度的升高，‘盛宴’、‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’幼苗的葉片葉綠素含量隨之下降，且各草種幼苗的葉綠素含量在不同汞濃度脅迫下均存在顯著差異(P<0.05)。30～60 mg·L-1汞脅迫下，各草種葉片的葉綠素含量均顯著低于對照(P<0.05)，表明中低濃度的汞脅迫已足以影響到4個草種幼苗葉片的葉綠素合成與積累；當汞脅迫濃度為90 mg·L-1時，4個草種幼苗的葉片葉綠素含量持續顯著下降；當汞脅迫濃度達到120 mg·L-1時，‘盛宴’、‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’的葉片葉綠素含量分別較對照顯著降低87.2%，77.1%，75.4%，74.4%(P<0.05)。4個草種中‘盛宴’的葉綠素含量降幅最高，表明高濃度汞脅迫嚴重抑制幼苗葉片葉綠素的合成。

采用Microsoft Excel 2016進行數據分析處理及圖表繪制，參照Li等的方法用SPSS 16.0軟件對數據進行單因素方差分析(Ducan)[21](P<0.05)。參照馬婷燕等[22]的方法，運用隸屬函數法將各項指標測定值進行標準化處理，按照公式(1) (2)分別計算出出苗率、株高、干重、葉面積、葉綠素含量、PS Ⅱ原初光能轉化效率(Fv/Fm)、根系活力、SS含量、和MDA含量9個耐汞指標的隸屬函數值。

圖2 不同濃度汞脅迫對4個草種幼苗的葉綠素含量、PS Ⅱ原初光能轉化效率(Fv/Fm)的影響Fig.2 Effects of different concentration mercury stress on chlorophyll content,PS II original light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of four varieties seedlings

2.3 不同濃度汞脅迫對4個草種幼苗根系活力、SS含量、MDA含量的影響

如圖3所示，不同濃度汞脅迫對4個草種的根系活力、SS含量、MDA含量具有不同程度的影響。

2.3.1根系活力 根系活力反映植物在逆境脅迫下的根系生理狀況[29]。隨著汞脅迫濃度的升高，4個草種的根系活力均隨之降低。在低濃度(30 mg·L-1)汞脅迫下，僅‘傳奇’和‘金皇后’幼苗的根系活力顯著下降，降幅分別為23.3%和43.7%(P<0.05)；當汞脅迫濃度為60 mg·L-1時，‘傳奇’和‘派尼’的根系活力開始顯著下降(P<0.05)，而‘盛宴’的根系活力直到汞脅迫濃度大于90 mg·L-1時才顯著低于對照(P<0.05)。當汞脅迫濃度為120 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘傳奇’、‘派尼’的根系活力較各自對照下降了63.9%，76.0%，76.7%，95.8%，表明該濃度汞脅迫均嚴重抑制各草種幼苗根系的正常代謝活動。

2.1.4葉面積 重金屬脅迫會直接影響葉片面積，進而降低植株的光合能力[26]。由圖1可知，各草種葉面積隨汞脅迫濃度的升高而持續下降。當汞脅迫濃度為30 mg·L-1時，各草種幼苗的葉面積與對照無顯著差異，表明此時幼苗葉片的生長尚屬正常；當汞脅迫濃度達到60 mg·L-1時，‘傳奇’、‘盛宴’、‘派尼’、‘金皇后’幼苗的葉面積較對照均有顯著下降(P<0.05)，表明該濃度汞脅迫已對各草種幼苗的生長產生明顯抑制作用；當汞脅迫濃度達120 mg·L-1時，‘傳奇’、‘盛宴’、‘派尼’、‘金皇后’的幼苗葉面積較對照分別顯著下降47.5%，55.6%，58.4%和59.5%(P<0.05)，表明高強度汞脅迫嚴重抑制各草種幼苗的正常生長，其中‘金皇后’所受的抑制最為明顯。

2.3.2可溶性糖含量 葉片SS含量一定程度上反映植株遭遇脅迫以及通過調整胞內滲透勢抵御脅迫的能力[30]。由圖3可知，4個草種幼苗葉片的SS含量隨著汞脅迫濃度的升高呈下降趨勢；30 mg·L-1的低汞脅迫下，除‘派尼’外，各草種幼苗葉片的SS含量已顯著低于對照(P<0.05)。60 mg·L-1汞脅迫處理下，各草種葉片的SS含量均持續下降(P<0.05)，表明該濃度汞脅迫下，4個草種幼苗通過調節SS含量實施抵御脅迫的能力已受到抑制；汞脅迫濃度達到120 mg·L-1時，‘盛宴’、‘金皇后’、‘派尼’、‘傳奇’的SS含量較對照分別下降了66.7%，64.3%，63.6%，62.5%(P<0.05)，表明在該濃度汞脅迫下，各草種植株均已很難通過提高SS含量抵御汞脅迫。

2.3.3MDA含量 MDA作為葉片細胞膜脂過氧化產物，其含量是評價植株所受脅迫程度的重要生理指標[31]。由圖3可知，各草種幼苗的葉片MDA含量隨著汞脅迫濃度增高而持續升高。30 mg · L-1汞脅迫處理下，除‘盛宴’以外，‘派尼’、‘傳奇’、‘金皇后’幼苗的葉片MDA含量均顯著升高，意味著低濃度汞脅迫已經開始造成葉片膜系統的損傷；當汞脅迫濃度由60 mg·L-1升高到90 mg·L-1時，4個草種幼苗的葉片MDA含量持續升高(P<0.05)，但‘盛宴’和‘金皇后’的MDA增幅并不顯著，表明這一區間內，這兩個草種幼苗仍具備一定的抗性；當汞脅迫濃度升高到120 mg · L-1時，各草種葉片的MDA含量均顯著升高(P<0.05)。

圖3 不同濃度汞脅迫對4個草種幼苗的根系活力、SS含量、MDA含量的影響Fig.3 Effects of different concentration mercury stress on root activity,soluble sugar content,MDA content of four varieties seedlings

2.4 耐汞性綜合評價

通過對4個草種的出苗率、株高、干重、葉面積、葉綠素含量、PS Ⅱ原初光能轉化效率(Fv/Fm)、根系活力、SS含量和MDA含量這9項指標的隸屬函數值進行比較分析(表1)，得出 4個草種總的耐汞性排序為：‘派尼’>‘金皇后’>‘盛宴’>‘傳奇’。

表1 隸屬函數值及綜合排序Table 1 Value of membership function and comprehensive ranking

3 討論

逆境脅迫下，種子的出苗率首先受到不同程度的影響。本研究中，低濃度汞脅迫(30 mg·L-1)對4個草種的出苗率影響并不顯著，而生長30 d后幼苗的生物量則已反映出植株的受害情況，這與其他亞鐵離子[13]在低脅迫濃度下刺激生長有所不同，表明汞脅迫對各草種幼苗的傷害從低汞濃度脅迫下就已顯現。當汞脅迫濃度達到60 mg·L-1時，‘傳奇’和‘派尼’的出苗已表現出明顯的抑制效應，90～120 mg·L-1重度脅迫下，4個草種的幼苗根部均開始壞死，可見該脅迫濃度均已超出4個草種幼苗的耐受極限，根部組織結構受到嚴重損傷，嚴重影響幼苗的正常生長，這和高大翔等[11]的研究結果一致，即出苗率與植株所受的脅迫程度高度正相關。

汞是非植物生長的必需元素，當植物遇到汞脅迫時，根系是植物面臨汞脅迫最先受到損傷的器官，根系膜系統和結構的破壞不但嚴重抑制根際養分的輸送和碳水化合物的合成，更能導致根組織細胞屏蔽外界重金屬離子的能力降低[14]。養分的缺乏進一步導致葉綠素的合成受阻，汞離子隨水分運輸至地上各個組織器官，造成大量氧自由基在整個植株體內的積累[9]，當超出植株自身的抗氧化酶系統及滲透調節系統的生理修復能力后，最終導致幼苗的生長發育和體內干物質積累停滯甚至死亡[32-34]。本研究中，各草種的葉綠素含量、SS含量、根系活力及Fv/Fm值均隨植株生物積累量的迅速下降則印證了這一協同過程。如120 mg·L-1的汞脅迫能使各草種幼苗的根系活力和葉綠素含量分別顯著降低63.9%～95.8%和74.4%～87.2%(P<0.05)，株高降幅達到44.6%～57.5% (P<0.05)，植株干重和葉面積降幅也分別達到56.8%～80.7%和47.5%～59.5% (P<0.05)，表明高濃度汞脅迫對各草種幼苗的正常生長、光合作用等都產生嚴重抑制作用，這與鎘脅迫對小麥(TriticumaestivumL.)和斷續菊(Sonchusasper)生長影響的研究結果基本一致，即鎘濃度升高導致小麥[35]和斷續菊[36]植株的生物量及株高下降，汞脅迫導致小麥、桔梗(Platycodongrandiflorus)等植物的光合能力、抗氧化酶系統活性下降及干物質積累受到抑制[11-12]。同時在本研究中，各草種的MDA含量均隨汞脅迫濃度的升高而持續升高，各草種的MDA含量升高幅度因草種不同存在明顯差異，MDA含量升高越明顯表明植物受脅迫的生理傷害越嚴重，進而影響植物正常生長及生理代謝平衡[37]。

由于所耐受的脅迫因素不同，不同植物的生理、生長指標在重度脅迫下的受害表現基本趨同，而在中、低度脅迫下選擇適當的評價指標能夠迅速直觀的篩選出耐受能力較優的草種。在本研究中，除了用生物量和株高評判植物對重金屬脅迫的抗性外[24]，對汞脅迫而言，根系活力、葉片葉綠素及MDA含量是直觀反映各草種幼苗汞脅迫耐受能力的敏感指標，區分度好，可作為評價草種早期耐汞能力的重要參考指標。利用隸屬函數綜合評價4個草種的耐汞性，能在一定程度上反映4個草種的耐汞能力。

③二氧化碳氣體通入NaClO溶液中,無論二氧化碳少量還是過量,都發生反應CO2+NaClO+H2O==HClO+NaHCO3,而不會生成碳酸鈉,因酸性:H2CO3＞HClO＞HCO-3。

4 結論

在不同濃度汞脅迫過程中，當汞脅迫濃度達90 mg·L-1及以上水平時4個草種幼苗的出苗率、葉面積、株高、干重、葉片葉綠素含量，PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)，根系活力、可溶性糖(SS)含量開始明顯下降，而丙二醛(MDA)含量明顯開始升高，尤其汞脅迫濃度達120 mg·L-1時4個草種各測定指標的變化幅度最明顯，表明高濃度汞脅迫已對4個草種幼苗的生長及生理代謝產生了嚴重的損傷。4個草種總的耐汞性排序為：‘派尼’>‘金皇后’>‘盛宴’>‘傳奇’，可為汞污染地區土壤植物修復提供科學參考。