除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發和幼苗生長的影響

張金花， 何 靜， 張小彥， 張樹衡， 張 恒， 李彥湘

(甘肅農業大學林學院， 甘肅 蘭州 730070)

化感作用(Allelopathy)的概念最早由德國科學家Molish提出，是一種植物通過向環境釋放化學物質而對另一種植物(包括微生物)所產生的抑制或促進作用[1-3]。它也是自然界中廣泛存在的一種生態化學現象[4]，在許多植物參與競爭時發揮重要作用，尤其處于逆境時植物會采用化感作用的方式增強自身的生存競爭能力[5]。化感作用的實現一般要經歷3個主要過程：一、主體植物產生化感物質并能夠通過適合的途徑釋放到環境中；二、在自然條件下能夠以足夠的活性形態和濃度到達受體植物；三、受體植物能夠在一段時間內在化感物質的作用下受到影響。化感物質來源于植物的次生代謝物，是植物在次生代謝的過程中通過草莽酸途徑或醋酸途徑生成的，其結構簡單，相對分子質量小，主要分為酚類、萜類、糖苷類、生物堿和非蛋白氨基酸[6]。正是由于化感物質具有多樣的生物活性，獨特的作用方式和對環境友好等特點，已成為開發生物活性農藥的先導化合物之一[7]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)、紅豆草(Onobrychisviciaefolia)和黑麥草(Loliumperenne)為我國常見的3種優良飼草，在世界上廣泛栽培，具抗旱、高產、營養價值高等諸多優點，同時具有水土保持、土壤改良、地力培肥、植物修復等多重生態功能[8-9]。近年來，隨著我國農業產業結構調整力度的不斷加大，牧草種植面積在不斷擴大，草害問題也逐漸凸顯，成為影響生產的重要因素。為解決好這種短期有害與長期低產的問題，研究者對牧草化感作用的運用進行了研究。已有研究表明，紫花苜蓿、紅豆草和黑麥草對多種植物均具有較強的化感作用。紫花苜蓿對馬唐(Digitariasanguinalis)[10]、少花蒺藜草(Cenchrusspinifex)[11]、無芒雀麥(Bromusinermis)[12]、鴨茅(Dactylisglomerata)和披堿草(Elymusdahuricus)[13]等均具有化感作用且各器官間對受體植物的作用強度不同[14]。紅豆草對反枝莧(Amaranthusretroflexus)、狗尾草(Setariaviridis)、野燕麥(Avenafatua)、龍葵(Solanumnigrum)、白茅(Imperatacylindrica)和稗草(Echinochloacrusgalli)均有化感作用[15]。黑麥草4個品種對豬殃殃(Galiumspurium)和馬唐幼苗生長存在化感抑制作用[16]。

化學防治是目前最切實可行的除草方法，但化學藥劑的長期使用會導致土壤退化、污染環境等一系列的問題，而運用植物化感效應的途徑可減少除草劑的用量，能夠促進農業的可持續發展。孔垂華等[17]研究表明，受試植物在其逆境條件下，受化感物質的影響會使其化感作用顯著增強。近年來，關于植物化感方面的研究越來越多，主要集中于植物的化感效應[18]、生理生化及化感物質分離、鑒定等方面的研究[19]，但除草劑對作物的負效應及在推薦劑量下對牧草化感效應的研究還鮮有報道。本研究通過室內生測法，測定除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發和幼苗生長的影響，并結合化感效應指數的綜合效應值，明確受除草劑脅迫后的牧草化感活性作用，這將為提高牧草田除草效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試紫花苜蓿、紅豆草、黑麥草、小白菜種子均由華豐草業科技有限公司生產，其千粒重分別為：1.88 g，2.01 g，1.79 g，1.51 g，凈度分別為：97.7%，96.2%，95.9%，98.4%。

供試除草劑草甘膦(傳導型，草甘膦含量：46%，草甘膦異丙銨鹽含量62%)和草銨膦(膦酸類，具有部分內吸作用的非選擇性觸殺除草劑，有效成分含量200 g·L-1)是除草劑市場銷售額最大的兩種除草劑，均由浙江升華拜克生物股份有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1材料處理 挑選顆粒飽滿、長勢較好的牧草種子。紅豆草種子經70%酒精消毒20 s后用2% NaClO表面殺菌20 min；紫花苜蓿種子用50℃～60℃熱水浸泡30 min后自然風干；黑麥草經0.1% HgCl2消毒10 min；小白菜種子用1%的NaClO消毒30 min，蒸餾水沖洗3次，自然風干[20-23]。土壤選擇高溫滅菌的營養土，再將消毒處理的牧草種子播種在發芽盆中(直徑為9.6 cm)，3種牧草各27盆，每種牧草按除草劑的相應推薦劑量類型(1/2倍，1/4倍，1/8倍，1/16倍)分別進行標記，每個處理設置3盆，共計81盆。待牧草生長50 d后，用手持式噴霧器按標記每盆噴施5 mL的藥液(以清水為對照)。根據說明書，除草劑的施藥劑量分別為防治常見大田雜草推薦劑量的1/2倍，1/4倍，1/8倍，1/16倍，具體稀釋方法為：草甘膦分別取0.15 mL，0.075 mL，0.0375 mL，0.01875 mL分別配制成100 mL溶液；草銨膦分別取0.3 mL，0.15 mL，0.075 mL，0.0375 mL分別配制成100 mL溶液。3 d后進行取樣，將紫花苜蓿、紅豆草和黑麥草的地上部分齊地面割下，用蒸餾水洗凈雜質，自然風干后置于0～4℃的冰箱中保存備用。

1.2.2浸提液的制備 分別取27個處理的牧草各0.5 g，粉碎后置于三角瓶中，分別加入50 mL蒸餾水，制成質量濃度為0.01 g·mL-1牧草浸提液，在25℃下震蕩48 h(轉速150 r·min-1)，48 h后經定性濾紙和定量濾紙雙重過濾，濾液離心(3 000 r·min-1)10 min取上清液，即為3種牧草浸提液，置于0～4℃的冰箱里保存備用[24-25]。

1.2.3浸提液對受體植物的化感潛力測定選取籽粒飽滿、大小均一的受體植物種子置于鋪有兩層濾紙的培養皿中，每皿放入50粒，分別加入5 mL的牧草浸提液(共27種)，每個處理3次重復。于培養箱 [(25±1)℃]中培養、日光燈照射12 h·d-1，每隔2 d每皿添加2 mL的蒸餾水。每隔24 h記錄培養皿中受試植物種子萌發情況(以胚根突破種皮1～2 mm為標準)，第7 d統計種子發芽率(Germination rate,GR)、苗高(Seedling height,SH)和最大根長(Maximum root length,MRL)，每皿隨機挑選10株，測量單株根長和苗高[13]。分別計算各個對照和處理的發芽指數(Germination index,GI)和活力指數(Vigor index,VI)，以及各項指標的化感效應指數(Response index，RI)及綜合化感效應指數(Comprehensive allelopathy index，SE)。

1.2.4測定項目及方法 發芽率(%)=(發芽試驗終期發芽的種子數/受試種子總數)×100%

發芽勢(%)=(發芽數達高峰的前1/3天數內正常發芽種子數/供試種子數)×100%

發芽指數GI=∑(Gt/Dt)

活力指數=GI×S[26]

式中Gt是試驗時間內發芽的種子數，Dt為發芽的天數，GI為發芽指數，S為幼苗的根長。

苗高和根長的測定[27]：用尺子測量主根長度和苗高，從幼苗基部到主莖頂部，精確到0.1 cm。

參照Williamson[28]的方法計算化感效應指數(RI)：當T≥C時，RI=1-C/T；當T0時，表示促進作用；當RI<0時，表示抑制作用；RI=0時表示無化感作用，RI的絕對值代表作用強度。

綜合化感效應指數(SE)[29-30]：供體植物對同一受體植物的各個測試指標的RI的算術平均值，SE=(RI發芽率+RI發芽勢+RI發芽指數+RI苗高+RI最大根長+RI活力指數)/6。

1.2.5數據統計分析 用Excel 2019軟件處理數據并繪圖，應用SPSS 20.0軟件對數據進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，用Duncan’s多重比較法檢驗差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 影響受體植物種子萌發和幼苗生長的雙因素交互作用分析

由表1可知，就草銨膦而言，草銨膦劑量、牧草浸提液種類及其交互作用均對受體植物最大根長和活力指數的影響極顯著(P<0.01)，草甘膦也表現出同樣結果。此外，草銨膦脅迫下牧草浸提液種類對受體植物發芽指數的影響極顯著(P<0.01)；草甘膦脅迫下牧草浸提液種類均極顯著影響受體植物發芽指數和苗高(P<0.01)，草甘膦劑量和牧草浸提液種類均極顯著影響受體植物發芽率(P<0.01)。綜上，除草劑劑量、牧草浸提液種類及其交互作用均極顯著影響受體植物活力指數(P<0.01)，而除草劑種類對受體植物活力指數的影響最大。

表1 除草劑脅迫下牧草浸提液對受體植物種子萌發和幼苗生長影響的雙因素方差分析Table 1 Results of two-way ANOVA for the effects of three forage extracts on seed germination and seedling growth of recipient plants

2.2 除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響

2.2.1草銨膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響 由表2可知，隨著草銨膦脅迫劑量的增加，紫花苜蓿、紅豆草浸提液處理下對發芽率均呈降低趨勢。在對照組中，紅豆草浸提液處理下發芽率最低，與黑麥草浸提液差異顯著(P<0.05)。各劑量下的3種牧草浸提液處理對受體植物種子發芽率無顯著影響。總體而言，紅豆草浸提液對發芽率均表現為促進作用，紫花苜蓿浸提液在除草劑劑量超過1/4劑量表現為抑制作用、黑麥草浸提液在除草劑劑量超過1/8劑量表現為抑制作用。

表2 草銨膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響Table 2 Three forage extracts on seed germination of recipient plants under Glufosinate-ammonium stress

3種牧草浸提液處理下各劑量處理的發芽勢之間均無顯著性差異。1/8倍劑量下紅豆草浸提液對發芽勢的影響與黑麥草浸提液差異顯著(P<0.05)，其它劑量的浸提液處理之間無顯著性差異。此外，紫花苜蓿浸提液對發芽勢表現為抑制作用或無影響，紅豆草浸提液在草銨膦劑量不小于1/4倍時表現為促進作用，反之則為抑制作用，黑麥草浸提液在草銨膦劑量小于1/2倍時表現為促進作用。

此外，同一除草劑劑量下3種牧草浸提液對發芽指數的影響各不相同，1/4，1/16倍劑量下紫花苜蓿、紅豆草浸提液對受體發芽指數的影響與黑麥草浸提液差異顯著(P<0.05)；1/8倍劑量下3種牧草浸提液對受體發芽指數的影響差異顯著(P<0.05)，其中，紅豆草浸提液對發芽指數的抑制作用最強，化感指數為-0.09。可見，草銨膦脅迫下紫花苜蓿、紅豆草浸提液對發芽指數均表現為抑制作用，黑麥草浸提液對發芽指數表現為促進作用。

2.2.2草甘膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響 由表3可知，不同草甘膦劑量下，3種牧草浸提液的發芽率均與對照無顯著性差異。1/16倍劑量下黑麥草浸提液對發芽率的影響顯著高于紫花苜蓿、紅豆草浸提液(P<0.05)；在對照組中，黑麥草浸提液對發芽率的影響顯著高于紅豆草浸提液(P<0.05)，說明草甘膦脅迫對黑麥草的影響較小。此外，黑麥草浸提液對發芽率表現為抑制作用或無影響，紅豆草在1/2和1/8倍劑量下表現為促進作用，紫花苜蓿浸提液則表現為抑制作用。

表3 草甘膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響Table 3 Three forage extracts on seed germination of recipient plants under glyphosate stress

各劑量下3種牧草浸提液對發芽勢的影響各不相同，1/8倍劑量下紅豆草浸提液對發芽勢的影響顯著低于黑麥草浸提液(P<0.05)，紅豆草浸提液處理下，1/8倍劑量的發芽勢顯著低于其它劑量(P<0.05)。此外，紫花苜蓿、紅豆草浸提液對發芽勢表現為抑制作用，黑麥草浸提液則表現為“低促高抑”。總之，1/8倍劑量下紅豆草浸提液對發芽勢的抑制作用最強。

1/2倍劑量下，紫花苜蓿浸提液對發芽指數的影響顯著低于紅豆草、黑麥草浸提液(P<0.05)；1/8倍劑量下，3種牧草浸提液之間差異顯著(P<0.05)。紅豆草浸提液處理下，1/8，1/16倍劑量與對照相比發芽指數顯著降低(P<0.05)。由RI指數可知，紫花苜蓿、紅豆草浸提液對發芽指數表現為抑制作用，黑麥草在1/2，1/4倍劑量時表現有一定的促進作用。

2.2.32種除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的雙因素方差分析 由表4可知，在1/8倍劑量下G+HD處理下的發芽率最低，與A+MX，A+HM，G+HM處理差異顯著(P<0.05)，除1/8倍劑量外，其它劑量間的發芽率均無顯著性差異。此外，除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體種子的發芽率均無影響，3者之間無顯著性差異。說明草銨膦、草甘膦各劑量下牧草浸提液對發芽率的影響較小。

表4 2種除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物種子萌發的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of three forage extracts on seed germination of recipient plants under two herbicides stress

草銨膦、草甘膦各劑量下牧草浸提液對發芽勢的影響各不相同。其中，1/2倍劑量下G+MX的發芽勢顯著低于A+HD(P<0.05)；1/8倍劑量下G+HD的發芽勢顯著小于A+HM和G+HM(P<0.05)。另外，對照組3種牧草浸提液對發芽勢的影響均無顯著性差異。

草銨膦、草甘膦脅迫下紫花苜蓿、紅豆草浸提液對發芽指數的影響與對照相比均有不同程度的降低。其中，1/8倍劑量下G+HD的發芽指數降低最為明顯，較對照降低了13.20%。1/2倍劑量下G+MX對發芽指數的影響與其他劑量處理差異顯著(P<0.05)；1/4倍劑量下A+HM對發芽指數的影響明顯高于其他劑量。可見，草甘膦脅迫下牧草浸提液對受體植物種子萌發的影響大于草銨膦。

2.3 除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的影響

2.3.1草銨膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的影響 由表5可知，各劑量下，3種牧草浸提液處理下的苗高均與對照無顯著性差異。在草銨膦1/2倍劑量下紅豆草浸提液對苗高的影響顯著高于黑麥草浸提液(P<0.05)，在對照組中，紅豆草浸提液處理下的苗高顯著高于黑麥草浸提液(P<0.05)。此外，紫花苜蓿僅在除草劑劑量為1/8倍時對苗高表現為抑制作用，紅豆草浸提液僅在除草劑劑量為1/2倍時對苗高表現為促進作用，黑麥草浸提液僅在除草劑劑量為1/2倍時候對苗高表現為抑制作用。

表5 草銨膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的影響Table 5 Three forage extracts on the seedling growth of recipient plants under Glufosinate-ammonium stress

各除草劑劑量下黑麥草浸提液對最大根長和活力指數均表現為促進作用，且1/2，1/8/，1/16倍劑量下黑麥草浸提液對根長和活力指數的影響顯著高于對照處理(P<0.05)。此外，1/16倍劑量下紫花苜蓿浸提液對幼苗根長和活力指數的抑制作用均最強，抑制率分別為31.81%，33.56%；1/8倍劑量下紅豆草浸提液對最大根長和活力指數的抑制作用均最強，抑制率分別為46.79%，51.55%，該劑量下黑麥草浸提液則表現為促進作用。可見，牧草浸提液對活力指數的影響與最大根長基本一致。

2.3.2草甘膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的影響 由表6可知，草甘膦脅迫下紅豆草、黑麥草浸提液對幼苗苗高的影響與對照處理無顯著性差異；同時，除1/16倍劑量外，其他劑量下黑麥草浸提液對幼苗苗高的影響較對照差異顯著(P<0.05)。在對照組中，紅豆草浸提液對幼苗苗高的影響顯著高于黑麥草浸提液(P<0.05)。此外，紫花苜蓿、紅豆草、黑麥草浸提液對苗高影響最大的劑量分別為1/16，1/2，1/16，以1/16倍劑量下黑麥草浸提液對幼苗苗高的抑制作用最強。

表6 草甘膦脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的影響Table 6 Three forage extracts on the seedling growth of recipient plants under Glyphosate stress

草甘膦脅迫下紫花苜蓿、紅豆草浸提液對幼苗的根長和活力指數均表現為抑制作用，抑制率均大于80%，且紫花苜蓿、紅豆草浸提液對幼苗根長和活力指數的影響大于黑麥草浸提液。其中，在同一劑量下，紫花苜蓿、紅豆草浸提液對幼苗根長、活力指數的影響較對照差異顯著(P<0.05)。此外，紫花苜蓿、紅豆草、黑麥草浸提液對幼苗根長和活力指數影響最大的劑量均為1/4，1/16，1/16，以1/16倍劑量下紅豆草浸提液對幼苗根長和活力指數的抑制作用最強。

2.3.32種除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的雙因素方差分析 由表7可知，1/2倍劑量下G+HM的苗高最小，除此之外，其他劑量下各處理的苗高之間無顯著性差異，除草劑脅迫下紫花苜蓿、紅豆草、黑麥草浸提液對幼苗苗高影響最大的劑量分別為G1/16，G1/2，G1/2。

表7 2種除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物幼苗生長的的雙因素方差分析Table 7 Two-way ANOVA analysis of three forage extracts on seedling growth of recipient plants under two herbicides stress

草甘膦、草銨膦脅迫下3種牧草浸提液對幼苗根長和活力指數的影響均較明顯。其中，除草劑脅迫下紫花苜蓿、紅豆草、黑麥草浸提液對幼苗根長、活力指數影響最大的推薦劑量均是G1/4，G1/16，G1/2。同時，以1/16倍劑量下G+HD的幼苗根長和活力指數最小。另外，在對照組中，黑麥草浸提液對根長、活力指數的影響與其它2種浸提液相比差異顯著(P<0.05)。總之，在1/16倍劑量下G+HD處理能有效抑制幼苗根部發育。

2.4 化感綜合效應指數(RI)分析

結果表明，在草銨膦脅迫下，僅有黑麥草化感作用表現為明顯的促進作用，其它2種牧草的化感作用表現為“高促低抑”的雙重效應，且3種牧草的化感作用表現為：黑麥草>紅豆草>紫花苜蓿。在草甘膦脅迫下，3種牧草的化感作用整體表現為明顯的抑制作用，但對黑麥草的化感作用與其它2種牧草相比不明顯，3種牧草的化感作用表現為：紅豆草>紫花苜蓿>黑麥草。可見，草甘膦對紫花苜蓿、紅豆草的化感作用明顯大于草銨膦，黑麥草則對草銨膦更為敏感(圖1)。

圖1 除草劑脅迫下3種牧草浸提液對受體植物綜合化感效應指數的影響Fig.1 Three forage extracts on the synthetical allelopathic effect of recipient plants under herbicide stress

3 討論

該研究利用2種除草劑對3種牧草進行脅迫處理，測定除草劑脅迫下牧草浸提液對受體植物發芽率、發芽勢、發芽指數、苗高、最大根長和活力指數的影響。結果表明，草甘膦脅迫下紅豆草和紫花苜蓿浸提液對受體植物的根長和根系活力影響最大，抑制率均大于80%，說明化感物質可以通過抑制胚根的生長，破壞亞細胞結構，導致植物激素及活性氧不能正常合成與代謝，阻礙根系生長，造成植株生長發育滯緩[31]。也有研究表明在逆境脅迫下牧草的化感作用會增強[32]，推測化感作用的強弱與其化感物質的變化有關。朱曉紅等[33]發現逆境脅迫可增加牧草的化感代謝物質，以更好的適應外界環境的變化，同時抑制其他植物的生長。由此可見，除草劑脅迫下牧草浸提液抑制受體植物根的生長與其化感物質的含量有關。

化感作用是植物普遍存在的一種化學防御機制，它對于植物的生長發育以及生存競爭都有著重要意義[34-36]。利用化感物質來防治雜草是化感作用的應用潛力之一，其中，逆境脅迫對牧草化感作用深入研究對優化牧草與農、經作物復合種植體系、生防除草、培育化感抑草新品種及開發新型除草劑均具有廣闊的前景[37]。本研究表明，除草劑脅迫對牧草化感作用的影響與牧草自身的特性、除草劑種類和劑量密切相關，也與除草劑的傳導機制有關。此外，牧草對除草劑脅迫的敏感性響應不盡相同。草甘膦為5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP)抑制劑，草銨膦為谷氨酰胺合成酶(GS)抑制劑，二者均屬含磷氨基酸類除草劑[38]。草甘膦主要抑制植物體內烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶活性，使蛋白質的合成受到干擾導致植物死亡[39-40]。草銨膦主要通過抑制植物體內的谷氨酰胺合成酶活性，從而破壞植物細胞膜，使植物光合作用受阻而枯死[41]。本研究發現，黑麥草和紫花苜蓿在草銨膦推薦劑量1/16倍劑量下|RI|最大，紅豆草在1/8倍推薦劑量下|RI|最大，且對牧草化感作用的強弱順序為：黑麥草>紅豆草>紫花苜蓿；紅豆草在草甘膦推薦劑量1/8倍劑量下|RI|最大，紫花苜蓿在1/2，1/4倍推薦劑量下|RI|均最大，黑麥草在1/2倍推薦劑量下|RI|最大，且對牧草化感作用的強弱順序為：紅豆草>紫花苜蓿>黑麥草。推測其化感效應的變化可能與除草劑類型和牧草自身的化感作用有關。此外，除草劑脅迫下對牧草化感作用的影響還與除草劑的持效期長短、化感物質的變化及對牧草的生理生化的影響有關，這也正是本研究下一步要重點探明的問題。

4 結論

除草劑脅迫下可明顯增強紫花苜蓿、紅豆草和黑麥草的化感作用，其中，草甘膦對紫花苜蓿和紅豆草化感作用的影響大于草銨膦，而草銨膦對黑麥草化感作用的影響大于草甘膦。除草劑脅迫下牧草產生的化感作用和除草劑的雙重效應下可以提高抑草效果，因此，在牧草田施用除草劑時應考慮其推薦劑量和對作物的化感效應。本研究對牧草田防除雜草時提高抑草作用具有良好的應用前景，也為科學使用除草劑提供參考依據。