不同季節高寒草甸牧草瘤胃發酵特性和體外消化率分析

姚喜喜， 才 華， 劉皓棟， 李長慧*

(1. 青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2. 青海省澤曲林場， 青海 黃南 811400；3. 甘肅畜牧工程職業技術學院， 甘肅 武威 733006)

生育時期是影響牧草營養品質的一個重要因素，天然草原缺乏人為管理，如施肥、灌溉、除雜草、防病蟲鼠害等，所以生育時期對天然牧草的影響顯得尤為關鍵[1]。隨著牧草的生長發育，牧草的養分含量和消化率也會出現不同程度的變化。對青藏高原高寒牧區牧草而言，因其獨特的生態環境條件，夏季牧草營養價值顯著高于冬季和春季[1]，據報道，夏季牧草表現出粗蛋白質和瘤胃消化率較高，而粗纖維含量較低的現象[2-3]。郝力壯等[4]和林莉等[5]分別研究了青海三江源區不同草地、不同生育時期牧草綜合營養品質和草地合理載畜量，當生育時期處于枯草期時，牧草中的磷和粗蛋白含量較少，因此能為家畜提供的營養物質有限。有研究對青海牦牛冬季飼喂粗飼料和5種天然牧草進行組合來探究體外發酵變化，發現體外發酵參數與底物營養成分具有相關性[6]，理想狀態下，氣體產量與CP成正比，與ADF，NDF成反比；乙酸、丙酸的含量以及CH4含量都與粗蛋白成正比，其中CH4含量也與酸性、中性洗滌纖維成正比。樊金富和金海[7]運用飽和鏈烷烴法，檢測了牧草在3個不同時期時，奶牛DMI和DMD以及牧草營養成分含量，發現幼嫩期牧草CP含量最高，旺盛期GE含量最高，枯黃期NDF，Ca和P最高，牧草幼嫩期與旺盛期的干物質采食量和消化率都優于枯黃期。Niwinska等[8]通過研究發現，不同季節紫花苜蓿(MedicagosativaL.)營養成分不同是因為不同季節下紫花苜蓿的營養物質化學組分和結構及其消化過程均存在差異。青藏高原牧草在5—10月份正值生長期，土壤中的養分也因為季節的不同呈現出不同變化[9]。牧草的生長發育會表現出由返青期到枯黃期的季節性變化規律，返青過程中牧草的營養含量最高，生長期結束后，牧草的成熟和木質化進程開始，營養價值開始下降[10]。

溫室效應最大的影響因素就是二氧化碳的排放量，然而CH4排放引起的溫室效應同樣不容小覷。雖然CH4的排放量比二氧化碳少，然而其造成的溫室效應卻遠高于二氧化碳，全球由CH4排放造成的溫室效應占到了20%[11]。據相關數據統計，反芻動物每年排放的CH4占全球人類活動CH4排放總量的6%[12]。CH4氣體過多排放會對大氣和生態環境造成威脅，CH4是能量的載體物質，減少其排放，不僅能夠提高營養物質的利用效率和減少溫室效應，還能提高動物生產性能[13]。本研究則是基于青藏高原瑪曲縣高寒草甸為研究對象，通過采集不同生育時期的牧草進行牦牛瘤胃體外發酵試驗，測定其瘤胃內CH4產量，為準確評估放牧牦牛CH4排放提供研究基礎。

自20世紀80年代青藏高原草原資源科考以來[14]，對天然草地自然生長牧草的營養價值動態變化的研究較少，而且研究多集中于國外，目前國內對天然草地牧草相關方面的研究主要集中在甘肅、西藏和內蒙古等地區，對青海海北州祁連縣相關方面的研究較少。鑒于上述，本試驗通過系統研究青藏高原高寒草甸草原不同生育時期天然牧草品質、牦牛瘤胃體外發酵參數及CH4排放動態，以期為高寒牧區牦牛合理放牧和減緩CH4排放，減少溫室氣體排放，實現高寒草地畜牧業可持續發展提供理論支撐。

1 材料及方法

1.1 研究區概況

研究地區位于青海省海北藏族自治州祁連縣(100°55′E,37°57′N)，屬典型的高原大陸性氣候，溫差較大，冬春季長而寒冷，夏秋季短，平均海拔3 169 m，年平均降水量420 mm，約85%的降雨量主要集中在牧草生長季的5—10月份，平均氣溫在1℃，其中最高溫度與最低溫度分別為8℃和-3℃。草地類型屬高寒草甸，以矮生嵩草(Kobresiahumilis)、針茅(StipacapillataLinn.)、早熟禾(PoaannuaL.)和披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)為優勢種牧草，土壤為亞高山草甸土。

1.2 試驗設計

本研究以10頭3歲牦牛全年放牧的輕度退化高寒草甸(面積24 hm2)為研究對象，放牧強度為輕度放牧(2.0個羊單位·hm-2)，分別在牧草返青期(2020年5月12日)、青草期(2020年8月8日)和枯草期(2020年12月5日)3個生育時期選擇代表性樣地，利用標準草地調查樣方(0.5 m × 0.5 m)隨機選取15個樣點進行草地調查，3個不同的牧草生育時期草地調查信息如表1所示。牧草樣品留茬高度為2～3 cm，收集樣方內全部牧草，篩選出可食用和無毒的牧草放置于陰涼處，再裝袋帶回實驗室，在105℃烘箱中恒溫殺青0.3～0.5 h，后將所有樣品在65℃烘箱中恒溫烘24 h至恒重，開始進行粉碎工藝，過40目篩選，之后裝于6號自封袋，進行密封保存。

表1 草地植被組成Table 1 Composition of grassland vegetation

1.3 瘤胃液樣品采集與體外發酵設計

在10頭牦牛晨飼前，運用口腔導管法采集瘤胃液樣品，每頭約采集200～300 mL，共采集瘤胃液2 000～3 000 mL，將采集好的瘤胃液通過四層紗布過濾后，保存到事先已通入過量CO2且經(39±0.5)℃預熱的暖瓶中，整個操作在30 min內完成。將采集好的瘤胃液迅速轉移帶回實驗室備用。

人工緩沖液的配制參照Menke和Steingass的方法，分別由微量元素A溶液、緩沖液B溶液、常量元素C溶液、指示劑D溶液和還原劑E溶液按474 mL蒸餾水+0.12 mL溶液A+237 mL溶液B+237 mL溶液C+1.22 mL溶液D+50 mL溶液E配置而成。微量元素A溶液由13.2 g CaCl2·2H2O，10.0 g MnCl2·4H2O，1.0 g CoCl2·6H2O和8.0 g FeCl3·6H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。緩沖液B溶液由4.0 g NH4HCO3和35.0 g NaHCO3加蒸餾水定容至500.00 mL組成。常量元素C溶液由5.7 g Na2HPO4，6.2 g KH2PO4和0.6 g MgSO4·7H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。指示劑D溶液由100 mg C12H7NO4和100 mg刃天青加蒸餾水定容至50.00 mL組成。還原劑E溶液由4 mL 1 mol·L-1NaOH和0.625 g Na2S·9H2O加蒸餾水定容至50.00 mL組成。將配置好的人工緩沖液混合后水浴加熱至39℃，通入CO2使混合營養液由藍色變為粉紅色直至無色，最后將混合營養液與瘤胃液以2∶1體積比混合，即為培養液[15]。

體外產氣裝置采用美國ANKOM RFS型全自動體外產氣記錄儀。每個牧草樣品設置3個重復，每個重復準確稱取樣品0.500 0 g，精確到0.000 1 g，裝入相對應編號的體外發酵瓶底部，先在恒溫水浴搖床中預熱至39℃，通入一定量的二氧化碳來排除氧氣，再加入120 mL預熱(39℃)的培養液，再次排出O2，將容器放置于水浴搖床中，恒溫39℃，維持2 d，期間，記錄各發酵時間點(6，12，24，48 h)的產氣壓力，隨后進行CH4產量測定(密封氣體進樣針采集5 ml發酵瓶上部氣)，在設定時間點取出對應發酵瓶，立即放入事先準備好的冰水中，目的是終止其發酵，將發酵瓶中的液體進行瘤胃發酵參數測定，收集殘渣用于體外消化率測定。

1.4 測定指標及方法

采用氧彈式熱量計來測定牧草GE；DM和EE分別采用烘干法和索氏抽提法測定[16]；采用全自動凱氏定氮儀(Foss Kheltec 8400)測定粗蛋白含量[17]；使用全自動纖維分析儀(ANKOM 2000 Fiber Analyzer)，采用Van soest纖維分析法測定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)[18]；粗灰分(Ash)采用灰化法[16]；礦質元素鈣(Ca)采用高錳酸鉀法[16]；礦質元素磷(P)采用釩-鉬黃比色法[16]。

對于體外消化率測定：準確稱取樣品(1.000 0 g)放入已知重量的尼龍袋中(400目；3.0 cm×5.5 cm)，每個樣品設置3個重復。將裝有樣品的尼龍袋放入發酵罐中，同時設置空白對照和標準苜蓿組來消除系統誤差，將各發酵罐放入體外培養箱中預熱至39℃，取出后通入二氧化碳，每個發酵罐裝入1 600 mL預熱(39℃)的培養液(無色狀態)，通入二氧化碳排出氧氣再放入培養箱中進行培養(39℃)，培養48 h后取出尼龍袋，立即放入冷水中，終止其發酵，然后用39℃溫水對其進行細流沖洗，直到尼龍袋表面干凈為止，將其放于瓷盤中進行烘干至恒重，差減法計算樣品干物質消化率(Dry matter digestibility，DMD)，將3個重復樣品粉碎混合均勻，用常規營養分析方法進行測定酸性洗滌纖維消化率(Acid detergent fiber digestibility，ADFD)、粗蛋白消化率(Crude protein digestibility，CPD)、中性洗滌纖維消化率(Neutral detergent fiber digestibility，NDFD)、有機物消化率(Organic matter digestibility,OMD)[17-18]。本試驗采用標準苜蓿作標準對照，測得標準苜蓿的消化率后計算校正系數(F)，如DMD計算公式如下。

DMDS—所有試驗批次標準苜蓿樣品干物質消化率的平均數(%)；

DMDX—每次測試中標準苜蓿樣品干物質消化率(%)；

DMD(%)=100×(發酵底物重×DM%-發酵殘渣的DM量)/(發酵底物重×DM%)；

OMD(%)=100×(發酵底物重×OM%-發酵殘渣的OM量)/(發酵底物重×OM%)；

CPD(%)=100×(發酵底物重×CP%-發酵殘渣的CP量)/(發酵底物重×CP%)；

NDFD(%)=100×(發酵底物重×NDF%-發酵殘渣的NDF量)/(發酵底物重×NDF%)；

ADFD(%)=100×(發酵底物重×ADF%-發酵殘渣的ADF量)/(發酵底物重×ADF%)。

發酵參數、總產氣量和CH4產量測定：氨態氮參照Broderick和Kang提出改進的比色法進行測定[19]；氣相色譜儀(日本島津GC-2010 Plus)測定揮發性脂肪酸和CH4產量[20]；累計產氣量計算公式為：

Vx=VjPpsi×0.068004084

式中：Vx為產氣總體積(mL)；Vj為發酵瓶頂部空間體積(mL)；Ppsi為氣體測量系統自動記錄的壓力(kPa)。

1.5 數據處理

試驗數據使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。3個牧草生育時期的營養品質指標和生物量、牧草體外消化率、瘤胃體外發酵參數、體外發酵總產氣量和CH4產量進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同生育時期高寒草甸牧草生物量和主要營養物質

由表2可知，草地地上生物量在青草期最高(P<0.05)，草地生物量表現出隨牧草返青期-青草期-枯草期先增加后下降的趨勢，且在青草期地上生物量達到最高。生育時期對高寒草甸牧草主要營養物質發育規律表現出：牧草GE，CP和EE在青草期處于最高水平(P<0.05)，而DM，NDF和ADF含量在青草期最低(P<0.05)，牧草Ca和P含量在枯黃達到最高(P<0.05)。

表2 高寒草甸牧草主要營養物質的變化Table 2 Seasonal dynamics of general nutrients content of herbage in alpine meadow

2.2 不同生育時期高寒草甸牧草體外消化率

高寒草甸不同生育時期牧草各營養成分的體外消化率，在體外發酵不同時間均有一定程度的變化，但總體來說，高寒草甸牧草各營養成分在體外發酵不同時間均表現出青草期高于返青期和枯草期(表3)。青草期DMD，CPD和OMD在發酵不同時間均顯著高于返青期和枯草期(P<0.05)。

表3 生育時期對高寒草甸牧草體外消化率的影響Table 3 Effects of growth stages on the vitro digestibility of alpine meadow

2.3 生育時期對高寒草甸牧草瘤胃體外發酵參數的影響

由圖1可知，生育時期對高寒草甸牧草體外發酵參數影響顯著(P<0.05)。高寒草甸青草期牧草在體外發酵12，24和48 h時間點的NH3-N含量顯著高于枯草期(P<0.05)；青草期發酵在48 h乙酸和丙酸含量處于最高水平(P<0.05)；青草期發酵的12，24和48 h，戊酸、異戊酸和乙酸/丙酸顯著高于枯草期(P<0.05)。

圖1 生育時期對高寒草甸牧草體外發酵參數的影響Fig.1 Effects of growth stages on the parameters of herbage in vitro fermentation in alpine meadow注：同一發酵時間不同生育時期標注的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.4 生育時期對高寒草甸牧草體外發酵總產氣量和CH4產量的影響

由圖2可知，瘤胃體外總產氣量和CH4產量隨著發酵時間的推移，呈增加趨勢。生育時期對高寒草甸牧草牦牛瘤胃體外不同發酵時間(6，12，24，48 h)總產氣量和CH4產量均產生顯著變化(P<0.05)，瘤胃體外發酵48 h總產氣量和CH4產量顯著處于最高水平(P<0.05)，體外發酵24 h總產氣量和CH4產量顯著高于發酵6，12 h總產氣量和CH4產量(P<0.05)，體外發酵12 h總產氣量和CH4產量顯著高于發酵6 h總產氣量和CH4產量(P<0.05)。3個時期牧草不同發酵時間(6，12，24，48 h)總產氣量和CH4產量的變化規律為返青期>青草期>枯草期(P<0.05)。

圖2 生育時期對牧草體外發酵總產氣量和CH4產量的影響Fig.2 Effects of growth stages on forage total gas production and CH4 production in vitro fermentation注：同一發酵時間不同生育時期標注的不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level

3 討論

3.1 生育時期對高寒草甸牧草營養品質的影響

青藏高原因其獨特的高寒低溫氣候特點，天然草原牧草生長發育也表現出明顯的季節性變化，即“春生，夏長，秋冬枯”。4—6月初，高寒草甸牧草由萌芽期進入返青期，6—8月快速生長，隨營養物質的積累出現旺盛期，自9月上旬開始，牧草開始進入枯黃期，營養物質逐漸流失，地上生物量不再增加，直至次年牧草再次返青，進入第二個生育期，周而復始。

本研究中牧草CP，EE，ADF和NDF含量存在明顯的季節動態變化特征，5月份返青牧草因含有較多的立枯物而表現出CP和EE含量顯著低于青草期，至9月份青草期CP和EE含量達到最大值，之后隨生育期推移，從青草期至枯草期逐漸下降，在枯草期12月份降到最低值，而牧草ADF和NDF含量的季節動態變化趨勢則與牧草CP和EE含量變化趨勢相反，即自5月份牧草返青時開始下降，至9月份青草期，其含量呈現最低值，而后由于牧草生育時期的延遲，從青草期至枯草期逐漸升高，在枯黃期12月份出現最高值，這與前人在典型草原、荒漠草原和高寒草原的研究結果一致，發現返青期和青草期牧草DM，NDF和ADF含量較低，而CP和EE含量則與之相反，與本研究結論一致[3,22-24]。牧草的呼吸能力由氣溫控制，氣溫高則呼吸快，由于牧草可進行光合作用，光合作用在消耗非結構性碳水化合物的同時，使得牧草中DM含量得以增加，進而導致牧草中結構性碳水化合物含量增加，造成牧草CP和EE含量顯著下降[3,27]。

研究發現牧草消化率表現出明顯的隨生育時期變化特征[25-26]。本研究中牧草營養物質消化率受到生長季節的影響比較大，總體上先升高后下降，高寒草甸返青期、青草期和枯黃期牧草DMD，CPD和OMD在體外發酵不同時間均表現出青草期顯著高于返青期和枯草期，NDFD和ADFD體外發酵不同時間均表現出青草期顯著低于返青期和枯草期。這與和海秀[21]在新疆沙爾套山牧草體外消化率四季變化規律一致，發現青草期牧草消化率最高。與梁建勇等[3]研究瑪曲高寒牧草干物質瘤胃降解率動態變化一致，發現6—7月青草期牧草體外發酵48 h降解率最高，8—9月枯草期牧草體外發酵48 h降解率最低。與范小紅等[27]的研究結果一致，DMD，OMD以及CPD的含量因牧草停止生長而減少，與此同時，牧草的NDF和ADF含量均增加，對應牧草成長時，DMD，CPD和OMD增加，而NDFD和ADFD下降。反芻動物瘤胃對鮮嫩多汁牧草的消化能力比多纖維干枯牧草的消化能力高，牧草中干物質和纖維含量決定了瘤胃消化率的高低。丁玲玲等[28-29]研究表明，土壤微生物對牧草營養物質的積累有顯著的影響，而微生物的數量受到時間的影響，一般在5月份時微生物數量最多，牧草處于青草期時，營養價值最高，隨著牧草生長，其營養價值因為牧草發生木質化過程而降低，證實了上述試驗中，在冬季牧草枯草期時，營養價值降低的結果。

3.2 生育時期對高寒草甸牧草瘤胃發酵參數和CH4產量的影響

氮元素是家畜自身最重要的營養元素之一，在家畜體內有著非常重要的生物學功能。對家畜而言，飼糧是最主要的氮素來源，采食是最重要的獲取氮素的方式之一。因此飼糧所含氮素的多少和可利用性(消化率)，決定了家畜能獲得多少氮素。這也為瘤胃微生物提供氮源有著重要的意義，瘤胃可作為基體，容納飼料中大部分蛋白質(70%)在此吸收與消化。反芻家畜的瘤胃中存在著眾多的微生物載體，例如細菌等，會使蛋白質水解產生游離氨基酸等分解產物，而這些分解產物，可促進瘤胃中微生物發生變化，進一步形成微生物蛋白質[30]。而反芻家畜瘤胃中NH3-N和MCP的濃度是間接反映出瘤胃發酵狀態的因素之一，Suwanlee等[31]通過分析，得到影響反應時NH3-N濃度，最合適時為0.8～56.1 mg·mL-1，在本試驗中，所有組體外發酵液NH3-N濃度范圍為6.84～12.67 mg·mL-1，均在最佳濃度范圍內，且青草期NH3-N濃度最高，這可能是因為青草期粗蛋白含量也最高的原因導致，與張盼盼等[33]研究內蒙東蘇旗不同季節牧草對瘤胃內環境的影響結果一致，NH3-N濃度隨牧草生育時期延長逐漸降低，與海存秀等[21]研究青海高寒牧草營養動態結果一致，6—7月青草期NH3-N含量達到峰值，然后逐漸降低。

反芻家畜瘤胃在碳水化合物發酵過程中，會生成較多的揮發性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)，包括乙酸、丁酸、異丁酸等，其含量占到了總VFA的95%[33]，在瘤胃發酵中扮演著及其重要的作用。反芻動物會將其采食的飼料在瘤胃內轉化成有機酸、微生物蛋白和氨等營養物質，經腸道上皮吸收，為其提供能量。而有機酸中乙酸和丙酸分別是進行氧化代謝和糖異生的重要媒介,所有代謝反應[34]均有丙酸參與。本研究中，青草期有機酸含量要高于返青期和枯草期，這可能是青草期碳水化合物含量最高的原因造成的，可促進發酵快速進行，而CP含量一般在春冬季比較低，可提供氮含量少，纖維降解菌可利用氮源少[32-33]。本試驗中，青草期牧草發酵48 h時，體外培養液的乙酸、丙酸和丁酸濃度顯著高于返青期和枯黃期，這表明非結構性碳水化合物含量在青草期較多，牧草的使用價值提高，制造微生物蛋白質的能力提高，這與張盼盼等[32]對內蒙東蘇旗不同季節牧草瘤胃內環境的影響研究結果一致，在6—8月，綿羊瘤胃中乙酸等物質的濃度都高于12月，夏秋兩季差異不顯著。

總產氣量和CH4產量的高低反映了牧草在瘤胃中的可發酵程度和瘤胃微生物的活性強弱[35]。目前，有關生育時期對反芻家畜瘤胃發酵總產氣量和CH4產量影響的相關文獻報道較少。本試驗中，返青期牧草在瘤胃中的可發酵程度顯著高于青草期和枯草期，瘤胃微生物活性明顯增強，表現為返青期牧草不同發酵時間(6，12，24，48 h)總產氣量和CH4產量顯著高于青草期和枯黃期，且隨著牧草體外發酵時間的延長，瘤胃體外總產氣量和CH4產量整體均呈現增加趨勢。這可能是牧草中碳水化合物含量在青草期較高，在進行發酵時，可快速進行，而返青期和枯草期牧草CP含量低，纖維降解菌可利用氮源不足，瘤胃的發酵速度因為其對應微生物的數量以及活性的降低而減慢，進一步影響CH4以及氣體總含量。劉樹軍[36]在其研究中表明：飼草的品質與其產生CH4的多少成反比關系，與上述試驗結果一致，發酵水平高的飼草，因為產生的CH4少，可有效控制溫室效應加劇，飼料的使用價值也更高。張畢陽等[37]研究指出：瘤胃產生的氣體含量與自身優劣成負相關；與體內消化速度成正比，證實了造成瘤胃的發酵模式與CH4含量變化原因的相同結論。

4 結論

生育時期對高寒草甸牧草總能、粗蛋白、粗脂肪、干物質含量、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維等主要營養物質含量，牧草干物質體外消化率、粗蛋白體外消化率、有機物質體外消化率、中性洗滌纖維體外消化率和酸性洗滌纖維體外消化率，牧草瘤胃中乙酸、丁酸、異戊酸濃度、氨氮、甲烷排放量等發酵參數均有顯著影響，綜合考慮，青草期牧草生物量、營養品質和體外消化率最高，瘤胃發酵特性最佳，甲烷排放量最低。