8周有氧運動對Nrf2敲除鼠心肌纖維化的作用及機制

劉雨佳，白鵬云，張 磊，印 文

心肌纖維化可引起心肌僵硬、順應性降低、收縮功能降低，從而降低了心臟功能。心肌的纖維化是引發心律失常的重要誘因，同時也是多種心血管疾病的共同病理過程。心肌纖維化主要表現為心肌組織中成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的膠原蛋白（Collagen）沉積過度[1]。心肌膠原蛋白以Ⅰ型和Ⅲ型為主。Ⅰ型膠原蛋白（Colla‐genⅠ）較粗，抗牽拉能力強，保持室壁的強度，約占心肌膠原總數的85%；Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）較細，由于其較強的彈性和伸展性，在維持室壁的彈性方面起重要作用，在總膠原比例中約11%。心肌纖維化發生的分子基礎主要體現在兩個方面，一方面是膠原蛋白排列紊亂以及各型膠原蛋白比例失衡，另一方面是膠原蛋白表達水平異常增高[2]。研究證實，合成基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是降解ECM的關鍵酶，基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TⅠMPs）通過抑制MMP活性來調節其功能。在正常心肌組織中，MMPs和TⅠMPs維持著動態平衡，一旦MMPs和TⅠMPs比例失調，將會引起心肌纖維化的發生[3]。

研究[4]發現，氧化應激是誘發心肌纖維化的重要機制。體內活性氧（ROS）和抗氧化系統比例失衡引起氧化應激，ROS可以激活MMP，進而增加膠原纖維的生成和沉積，從而促進心肌纖維化的發展[5‐6]。核因子E2相關因子2（nuclear factor‐erythroid 2p45‐related factor 2，Nrf2）是細胞內的關鍵核轉錄因子，在調控細胞氧化還原狀態中承擔中樞調節作用，在多種疾病過程中起保護作用。在細胞受到氧化應激刺激時，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1（Keleh‐like ECH‐associat‐ed protein l）解離，從而被活化，轉位進入細胞核，通過與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相結合，啟動多種抗氧化酶基因轉錄，促進醌氧化還原酶（NQO1）、血紅素加氧酶1（HO‐1）等酶的生成。這些酶可以與細胞內多余的自由基發生反應，從而解除細胞的氧化應激狀態[7]。Nrf2在防治心肌纖維化過程中的重要作用在多項研究中得到證實[8‐10]。

有氧運動對多種疾病的防治都呈現出有益的效果。有研究發現，有氧運動可以改善心肌纖維化，進而增強心肌功能[11‐12]。而有氧運動改善心肌纖維化的機制仍不明確。前期研究發現，長期有氧運動可激活骨骼肌內Nrf2，進而上調了抗氧化酶的表達，增強了機體抗氧化功能。而有氧運動是否通過Nrf2途徑改善心肌纖維化？目前仍不明確。本研究以Nrf2敲除鼠為基礎，建立有氧運動模型，以探討Nrf2在有氧運動干預對心肌纖維化中的作用。

1 研究方法

1.1 研究對象

20只Nrf2基因敲除小鼠購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，8周齡，并采用同周齡野生型C57BL/6J小鼠（購自北京維通利華實驗技術有限公司）20只作為對照，根據基因型隨機分為野生安靜組（WC）、野生運動組（WE）、敲除安靜組（KC）和敲除運動組（KE），每組10只。動物飼養房內溫度控制在22～24℃，室內濕度維持在40%～60%，全天24 h自然燈光照明，不限制飲食飲水，采用標準嚙齒類動物常規飼料飼養。

運動訓練采用小動物跑臺跑步的形式。在正式訓練前，WE組和KE組小鼠先進行1周適應性訓練，坡度為0°，跑速為12 m/min（約75%最大攝氧量強度[13]），1次/天，每次15 min，共5次。正式訓練采用相同跑速，5次/周，60 min/次，共8周。WC組和KC組小鼠不訓練，籠中正常活動。

1.2 取材

所有取材距最后一次運動訓練均間隔至少48 h。小鼠脫頸椎處死，打開胸腔，取小鼠心臟，采用生理鹽水沖洗后稱量重量，然后用錫紙包裹，標記并立刻投入液氮冷凍。然后轉入超低溫冰箱保存，用于后續實驗。

1.3 全心質量指數測定

取材后的心臟進行稱重，計算全心質量指數（全心重/體重×100）。

1.4 Western blot測定蛋白表達

將2.2中凍存的心肌組織置于離心管，加入的RⅠ‐PA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑。將心肌剪碎后，高速勻漿；4℃靜置30 min，然后4℃下12 000 rpm離心30 min，取上清液備用。蛋白濃度采用BCA試劑盒測定。根據蛋白濃度計算蛋白上清液體積，以20μg作為每次電泳的總蛋白量。按照常規操作進行電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠（SDS‐PAGE）電泳、轉膜、5%BSA封閉2 h。加入用0.01 mol/L TBST稀釋的一抗（Nrf2，1：200；CollagenⅠ，1：200；CollagenⅢ，1：200；MMP2，1：200；TⅠMP2，1：200；NQO1，1：500；HO‐1，1：1 000；GAPDH，1：500），室溫脫色搖床上搖動孵育1 h，4℃孵育過夜；0.01 mol/LTBST漂洗3次，二抗孵育1 h。再次TBST漂洗3次，然后加入ECL化學發光液，通過熒光水平計算蛋白表達水平。

1.5 統計學分析

本研究中統計學處理均采用SPSS 22.0統計軟件，數據采用平均值±標準誤表示。研究中運動干預和基因型的主效應和雙因素交互效應采用雙因素方差分析。如果主效應不顯著，干預方式或同種基因型單因素作用采用獨立樣本T檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 研究結果

2.1 各組小鼠取材時全心質量指數

各組小鼠運動干預前體重無顯著性差異，干預后取材時的體重、心臟重量和全心重量指數如表1所示，KC組小鼠體重顯著低于WC組，而其余各組間無顯著性差異。各組的心臟重量和全心重量指數無顯著性差異。

表1 各組小鼠取材時的體重、心臟重量和全心重量指數Table1 Body Weight，Heart Weight，and Heart Weight/Body Weight Index in Each Group

2.2 各組小鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達

各組小鼠Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白的表達如圖1和表2所示，與WC組相比，KC組CollagenⅠ表達顯著增加，而KE組CollagenⅠ表達顯著高于KE組，但野生型小鼠和Nrf2敲除小鼠的運動組與各自的安靜組間均沒有顯著性差異。CollagenⅢ蛋白表達在各組間均無顯著性差異。

圖1 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達Figure1 The Expression of CollagenⅠand CollagenⅢ

表2 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達Table 2 The Expression of CollagenⅠand CollagenⅢ

2.3 各組小鼠MMP2和TIMP2蛋白的表達

如圖2和表3所示，KC組MMP2表達顯著高于WC組，KE組TⅠMP2表達顯著高于WE組。與WC組相比，KC組TⅠMP2的表達顯著增加，而KE組顯著高于WE組。MMP2/TⅠMP2如表3所示，KC組和KE組分別較野生鼠的同種干預方式組顯著升高，而同種基因型小鼠在運動干預后并沒有呈現顯著性差異。

圖2 MMP2和TIMP2蛋白表達Figure2 The Expression of MMP2 and TIMP2

表3 各組小鼠的MMP2、TIMP2和MMP2/TIMP2Table3 The Expression of MMP2，TIMP2，and MMP2/TIMP2.

2.4 各組小鼠Nrf2的蛋白表達

各組小鼠心肌Nrf2的蛋白表達如圖3和表4所示，與WC組相比，WE組顯著增加，而KC組顯著減少；KE組顯著低于WE組，而KE組和KC組間無顯著性差異。

圖3 各組小鼠Nrf2蛋白表達Figure3 The Expression of Nrf2 in Each Group

表4 各組小鼠Nrf2蛋白的表達Table4 The Expression of Nrf2 in Each Group

2.5 各組小鼠心肌抗氧化酶的表達

通過對抗氧化酶NQO1和HO‐1的蛋白表達檢測發現，Nrf2敲除鼠NQO1和HO‐1蛋白表達均顯著低于野生鼠的同種干預組，而有氧運動訓練增加了野生鼠HO‐1的蛋白表達，而對于Nrf2敲除鼠無明顯效果（見圖4、表5）。

圖4 各組小鼠NQO1和HO-1蛋白表達Figure4 The Expression of NQO1and HO-1 in Each Group

表5 各組小鼠NQO1和HO-1蛋白表達Table5 The Expression of NQO1and HO-1 in Each Group

3 分析討論

通過對Nrf2敲除鼠膠原蛋白的研究發現，Nrf2的缺失引起了膠原蛋白含量的紊亂，以Ⅰ型膠原蛋白的含量增多為主，Ⅰ/Ⅲ膠原纖維比例失調。S.A.CAⅠ等人[8]的研究證實葛根素通過激活Nrf2，減輕了心肌纖維化；鳶尾素同樣通過激活Nrf2，抑制了血管緊張素Ⅱ誘導的氧自由基（ROS）生成，減緩了心肌纖維化的進程[9]；積雪草酸通過Nrf2/HO‐1和TGF‐β1/Smads信號通路抑制了自發性高血壓大鼠的心肌纖維化[10]；L.LⅠ等人[14]的結果顯示，Nrf2激活可以通過抑制TGF‐β1/Smad3通路的激活改善心肌纖維化。這些結果均證明，Nrf2的激活可以改善心肌纖維化。本研究結果顯示Nrf2的缺失直接影響了膠原蛋白的比例，從而影響了心肌纖維化的進程。

MMP2/TⅠMP2是導致心肌纖維化的可能機制，可作為判斷心肌纖維化的標準。有研究[15]發現，MMP2與心肌纖維化的程度呈現明顯的正相關。在本研究中發現，Nrf2敲除鼠的MMP2表達增加，且MMP2/TⅠMP2顯著高于野生鼠。這一結果可能是由于Nrf2的缺失導致心肌內氧化應激狀態失衡所引起的。A.D.KANDASAMY[5]等人的研究證實了MMP2可以受到氧化應激的激活，從而引起心肌損傷。L.DANG等人[16]研究也認為，ROS的生成是誘發MMP2表達增多的關鍵因素。ROS同時又促進了炎癥反應的發生。炎癥反應與心肌纖維化存在著密切的關系[17]。炎癥細胞在炎癥反應發生時，大量分泌ⅠL‐1β、TNF‐α和TGF‐β1等一系列炎癥因子和促纖維化因子，成纖維細胞受到刺激而增殖，ECM的合成增強。如果ECM進一步的積聚，則促進了心肌纖維化的發生[18]。ROS可以通過作用于TGF‐β1/Smad通路促進ECM的沉積進而加重心肌纖維化[19]。Nrf2與纖維化的多項研究也呈現出與本研究相似的結果。Nrf2敲除鼠較野生鼠呈現出增多的MMP2表達和炎癥反應，并且Nrf2在調節ECM降解過程中具有保護作用[20]；Y.GUAN等人[21]證實了Nrf2通過ROS/TGF‐β1/Smad途徑抑制了腸纖維化；Nrf2通過使ROS失活，降低了ROS對TGF‐β1的作用，從而在減輕器官纖維化過程中起保護作用[22]。因此綜合推測，Nrf2的敲除引起細胞內氧化還原狀態的失衡，ROS生成以及炎性反應增加，刺激了心肌內膠原蛋白紊亂，與心肌纖維化相關的MMPs/TⅠMPs比例失衡，從而促進了心肌纖維化的進程。

研究結果顯示有氧運動可以促進心肌Nrf2的表達，且有氧運動可以增強下游抗氧化酶HO‐1的表達。而對于Nrf2敲除鼠，有氧運動對抗氧化酶的作用并不顯著，由此說明有氧運動對HO‐1的激活是Nrf2依賴性的。S.S.GOUNDER等人[23]通過6周中等強度的跑臺運動訓練發現，有氧運動增強了青年小鼠心肌Nrf2的表達，抗氧化酶NQO1、HO‐1和過氧化氫酶（CAT）表達也增加，并且有氧運動訓練同樣增強了老年小鼠心肌Nrf2的表達，抗氧化酶CAT和谷胱甘肽還原酶表達受到有氧運動的增強；M.SUN等人[24]采用8周中等強度跑臺運動訓練發現，有氧運動訓練增強了SD大鼠心肌Nrf2的作用，NQO1、CAT和SOD表達增加；有氧運動對衰老心肌Nrf2和抗氧化系統的增強效果也得到了證實[25]。這些都與本研究結果相一致。有研究證實，有氧運動可以改善心肌纖維化的進程。X.XU等人[26]研究結果顯示，運動可以可改善MMPs和TⅠMPs之間的平衡，減輕了心肌纖維化并維持心肌梗死后的心臟功能；N.MA等人[27]通過對老年大鼠進行12周中等強度有氧運動發現，運動通過增強心肌H2S的生物活性改善了衰老引起的心肌纖維化；L.XⅠAO等人[28]采用間歇性的研究也發現，運動可以抑制TGFβ通路，導致心肌組織纖維化和瘢痕形成減少；P.H.LⅠAO等人[29]采用游泳的運動干預方式同樣證明了運動訓練可以減輕衰老引起的大鼠心臟的心臟炎癥，肥大和纖維化損傷；尹懿等人[30]在高血壓模型中也證實，有氧運動可以改善高血壓誘導的心肌纖維化；H.WANG等人[11]的研究結果顯示，運動訓練可以通過激活PGC‐1α和Akt通路改善了糖尿病模型小鼠的心肌纖維化；在肥胖小鼠模型中也發現運動對心肌纖維化的顯著改善[31‐32]。在本研究中有氧運動并沒有顯著改善Nrf2敲除鼠的心肌纖維化，這說明有氧運動對心肌纖維化的作用可能對Nrf2具有依賴性，也可能有氧運動對Nrf2缺失引起的心肌纖維化無顯著作用。因此，Nrf2在有氧運動對心肌纖維化的調節作用仍待于進一步研究。

4 結論與建議

Nrf2的缺失能夠引起膠原蛋白紊亂和MMPs/TⅠMPs比例失衡，促進小鼠心肌纖維化的進程；有氧運動可以增強Nrf2及其下游抗氧化酶表達，這一機制可能在有氧運動改善心肌纖維化過程中起決定性作用。

為進一步驗證Nrf2通路在有氧運動對心肌纖維化的決定性作用，建議在今后的研究中通過構建心肌纖維化的有氧運動模型，檢驗Nrf2通路在其中的作用以確認其作用，并對其機制進一步探索，為運動改善心肌纖維化提供充分依據。