氨磺靈和秋水仙素誘導橡膠草四倍體效果的比較研究

楊玉雙，覃 碧，張繼川，張立群，聶秋海，劉實忠

（1中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海口 571101；2北京化工大學材料科學與工程學院，北京 100029；3北京玲瓏蒲公英科技發展有限公司，北京 101102）

0 引言

橡膠草(Taraxacum kok-saghyzRodin,TKS)為菊科(Asteraceae)蒲公英屬(Taraxacum)大角蒲公英組(Sect.Macrocornuta V.Soest)多年生草本植物(2n=2x=16)，原產于哈薩克斯坦，歐洲及中國新疆等地[1]。橡膠草根部可合成天然橡膠，含膠率在2.89%～27.89%之間[2]，其天然橡膠的分子結構與巴西三葉橡膠相同，均為順式-1,4-聚異戊二烯，且物理機械性能與三葉橡膠非常相似，可用于工業化生產[3]。此外，橡膠草具有生長收獲周期短（1年即可收獲，而三葉橡膠樹需要5～8年）[4]；種植區域廣（在亞熱帶和溫帶均可正常生長）；適合機械化種植和采收，具有較強的生長繁殖能力等諸多優點，使其成為最具商業開發前景的產膠替代作物之一[5-6]。野生橡膠草的含膠量和生物量偏低，且變異大[7]，不能滿足橡膠草產業化發展的要求，為此，科學家們在橡膠草種質創新和改良方面做了大量工作，并取得了顯著進步。其中，美國俄亥俄州立大學Cornish團隊利用育種手段將橡膠草的平均含膠量提高到9%，小規模種植產膠量可達三葉橡膠樹水平[8]。但由于橡膠草在大田中的生長活力和競爭力弱，自交不親和的特性使群體的優良特性無法穩定遺傳，使其實際的大田種植產量達不到預期效果，橡膠草的種質改良工作仍然任重道遠。

多倍體育種作為植物育種的重要手段之一，因多倍體植株常具有花大、抗逆性強、生長健壯和生物量大等特點，被育種家們廣泛應用于各種植物育種中[9-10]。20世紀40—50年代，歐美科學家利用秋水仙素誘導成功獲得四倍體橡膠草，并培育出四倍體橡膠草Navashin等品種，含膠量和干根產量均明顯提高，但由于年代久遠，相關研究信息及材料已無法找到[11-12]。2018年Luo等[13]利用秋水仙素誘導橡膠草種子獲得四倍體橡膠草植株，表現出一定的天然橡膠產量提高潛力。到目前為止，國內還沒有關于橡膠草多倍體育種的報道。

秋水仙素作為一種常用的化學誘變劑，一直廣泛地應用于植物多倍體誘導中[14-15]，但其有效誘導率低，且因與植物蛋白的親和性低，處理濃度大，對植物材料的毒害比較嚴重，容易造成誘導植株生長異常，甚至死亡[16-17]。Luo等[13]利用秋水仙素誘導橡膠草四倍體，誘變率最高只有4.92%，且秋水仙素的毒性導致橡膠草萌發率和成苗達率不到50%，許多誘導植株生長異常。可見，秋水仙素的毒性對橡膠草生長影響顯著，其多倍體誘導效果很不理想。氨磺靈，作為一種除草劑類誘變劑，因其與植物微管蛋白的親和性高，使用誘變濃度低，且對植物材料傷害較小，價格低廉等特點[18-19]，在植物染色體加倍中的應用逐漸增多[20-21]，且研究發現，氨磺靈在大蒜[22]、觀賞姜花[23]、西瓜[24]等許多植物上的多倍體誘導效果要好于秋水仙素。

本研究以橡膠草幼芽為試驗材料，采用浸芽法比較氨磺靈和秋水仙素2 種誘變劑的誘變效果，分析四倍體橡膠草的形態變化，旨在探尋獲得適用于橡膠草的四倍體誘變劑和誘變方案，為橡膠草的種質創新和品種選育提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為橡膠草品系CXCH，2017 年種植于中國熱帶農業科學院橡膠研究所橡膠草種質資源圃，2018年初收獲種子。

2種誘變劑分別選擇上海阿拉丁生化科技股份有限公司的氨磺靈（分析標準品）和上海麥克林生化科技有限公司的秋水仙素粉末（含量≥99%）。

試驗在中國熱帶農業科學院橡膠研究所橡膠草種質資源圃，于2018年9月—2020年5月份進行。

1.2 方法

1.2.1 多倍體誘導 采用浸芽法進行誘變處理。設置秋水仙素濃度為0.05%、0.1%、0.2%；氨磺靈濃度為0.01 mmol/L（約0.0003%），0.02 mmol/L（約0.0007%），0.04 mmol/L（ 約0.0014% ）和0.08 mmol/L（ 約0.0028%），對照采用無菌水浸泡30 min。橡膠草CXCH種子用1%雙氧水浸泡、殺菌1 h，之后用水沖洗干凈，放入帶濾紙的培養皿中萌發，當種子萌發，胚根長至5～10 mm左右時，進行誘變處理。處理時間分別為30 min，1 h，2 h，4 h 和8 h。每組處理100 個幼芽，3個重復。處理結束后用無菌水沖洗3 遍，然后移栽至培養土中正常培育，待植株生長至5～7片葉時，進行倍性篩選。

1.2.2 多倍體鑒定 流式細胞儀倍性分析：流式細胞倍性分析參考康向陽等[25]的方法，取待測植株新鮮葉片0.1～0.15 g 放入直徑6 cm 的玻璃培養皿中，滴加500 μL 細胞核提取液（CyStain UV Precise P05-5002，Partec 德國），用鋒利刀片一次性快速切碎葉片至糊狀，用尼龍網濾膜(30 μm)過濾到5.0 ml 離心管中，加入1.6 mL 的DAPI 染色液(Solarbio)，混勻染色30 s，將樣品移至上樣管，用流式細胞儀（Sysmex CyFlow Cube8，德國）檢測。

細胞學倍性鑒定：采用橡膠草根尖壓片法，參考楊玉雙等[26]的方法，切取待測植株約2 mm 長根尖，洗凈后用2 mmol/L 8-羥基喹啉溶液室溫預處理4 h，卡諾氏固定液（無水乙醇:冰醋酸=3:1）在4℃冰箱中固定24 h，無菌水漂洗5次，60℃條件下1.0 mol/L鹽酸解離10 min，再用無菌水漂洗5次，然后用改良卡寶品紅染色5 min 后壓片。在萊卡DM68 全自動生物光學顯微鏡（德國）下觀察染色體變化情況，拍照記錄。

1.2.3 誘變相關參數測定 發芽率和成苗率測定：誘變處理后，將各試驗組幼芽分別移栽至相應花盆中正常培育，30天以后計算成苗率。利用流式細胞儀和根尖染色體壓片技術篩選、鑒定四倍體植株，統計、計算誘導率和嵌合體率。

1.2.4 形態特征比較 氣孔特征比較：參照劉歡等[16]的方法，選取對照和多倍體植株各6株，撕取其植株葉片的下表皮，利用萊卡DM68全自動生物光學顯微鏡（德國）對氣孔的大小、密度等性狀進行觀察測定，并計算氣孔的長度、寬度，統計氣孔密度（每mm2中的氣孔數目），并拍照記錄。

葉形態比較：待處理后植株長出12 片新葉后，選取對照和多倍體植株各6 株，測定其葉長、葉寬（葉片中間最寬部位）、葉厚（葉片中間最厚部位），葉形指數（葉長/葉寬），每指標數據連續測3次。

花和種子形態測量：待處理后植株開花結果后，選取對照和多倍體植株各6 株，測定其花的長度、直徑（花基部最寬部位）和花桿的直徑（與花的連接處）、種子粒長和粒寬（種子最寬處），每指標數據連續測3次。

1.3 數據分析

本試驗數據用使用IBM SPSS Statistics 19 (IBM,New York,USA)軟件進行數據處理、方差分析及LSD多重比較等，所有數據用平均值表示。

2 結果與分析

2.1 誘變植株倍性鑒定

利用流式細胞儀對氨磺靈和秋水仙素處理的待測植株進行倍性檢測。結果顯示，氨磺靈和秋水仙素處理后都能誘導染色體加倍。流式細胞倍性鑒定結果顯示（圖1），對照橡膠草二倍體(2n=2x=16)的熒光通道值為200（圖1A）；變異植株，有的在熒光通道值400處出現一個單峰，DNA 含量較對照增加了一倍，為四倍體（圖1B）；有的在熒光通道值200和400處同時出現峰，為二倍體和四倍體的混倍體，即嵌合體（圖1C）。根尖染色體壓片觀察結果顯示（圖2），二倍體植株的根尖細胞內染色體數目為2n=2x=16（圖2A）；誘導后的四倍體植株染色體數目為2n=4x=32（圖2B），與流式細胞儀的倍性鑒定結果一致。具體倍性鑒定統計結果見表1。

圖1 橡膠草流式細胞倍性分析

圖2 橡膠草二倍體與四倍體的根尖染色體數比較

2.2 2種誘變劑對橡膠草多倍體誘變效果比較

氨磺靈不同濃度及時間誘變處理均能導致一定程度的誘變效果（表1）。隨著處理濃度和處理時間的增加，氨磺靈處理的成苗率呈下降趨勢。同一處理濃度下，隨著處理時間的增加，變異率逐漸減少，處理濃度為0.04 mmol/L時，不同處理時間的變異率均高于相應其它處理濃度的變異率，其中，0.04 mmol/L 處理30 min的誘變率最高，為14.08%。

秋水仙素的各處理也能產生一定程度的變異。隨著秋水仙素處理濃度和處理時間的增加，其成苗率呈下降趨勢，其中，0.2%處理濃度對橡膠草的成苗率影響最為明顯，當處理時間為30 min 時，成苗率僅為37%，當處理時間≥1 h 時，成苗率為0.00%。在0.05%和0.1%處理濃度下，隨著處理時間的增加，其誘變率逐漸降低，其中，0.1%秋水仙素處理30 min 的誘變率最高，為5.56%。0.2%處理濃度下的不同處理時間的變異率均為0.00%。

比較2種誘變劑的誘變效果（表1）：氨磺靈的處理濃度范圍為0.01～0.08 mmol/L，即0.0003%～0.0028%，明顯低于秋水仙素0.05%～0.2%的誘變處理濃度；氨磺靈處理的成苗率(60%～75%)要明顯高于秋水仙素處理的成苗率(0～59%)，而且其最高變異率14.08%也高于秋水仙素處理的最高變異率5.56%；而氨磺靈處理的嵌合體率為27.27%，明顯低于秋水仙素處理的75.00%。綜上可知，相對于秋水仙素處理，氨磺靈處理橡膠草的成苗率和變異率高，嵌合體率低，整體誘變效果更好，其中，0.04 mmol/L 氨磺靈處理30 min 的成苗率為71%，變異率14.08%，嵌合體率25%，為最佳誘變條件。

表1 氨磺靈和秋水仙素對橡膠草多倍體的誘導效果

續表1

2.3 四倍體植株與野生型二倍體植株形態特征比較

與野生型二倍體相比，四倍體植株葉片肥厚，葉色濃綠，生長較為緩慢，約60 天后，生長速度恢復正常。氨磺靈和秋水仙素處理后的四倍體植株形態特征變化基本一致。

氣孔特征：與野生型二倍體植株相比，四倍體植株的氣孔密度顯著減少(P<0.01)，氣孔顯著增大。二倍體植株氣孔大小為16.87 μm×6.77 μm（長×寬），四倍體植株氣孔為20.67 μm×9.07 μm；氣孔長和寬分別比二倍體增加22.53%和33.97%（表2）。

葉片形態：四倍體植株葉片與二倍體相比，葉長、葉寬和葉型指數無顯著變化，葉片厚度顯著增加（表2，圖3A）(P<0.01)，比二倍體葉片增厚85.71%。

花和種子特征：與二倍體植株相比，四倍體植株的花苞長度無顯著變化，而花苞直徑和花桿直徑顯著增大(P<0.01)，分別增大了23.51%和36.77%；四倍體植株的種子大小和千粒重均顯著大于二倍體植株(P<0.01)，其中，四倍體的種子千粒重達到了0.95 g，是二倍體種子千粒重的2.11倍（表2，圖3B和3C）。

圖3 二倍體與四倍體橡膠草形態特征比較

表2 二倍體與四倍體橡膠草植株的形態特征參數比較

3 討論

3.1 誘變劑和誘變條件的選擇

氨磺靈是二硝基苯胺類除草劑，也是一種有絲分裂抑制劑，與秋水仙素的誘導作用類似，通過抑制紡錘絲的形成，使染色體加倍[27]。本研究中，氨磺靈處理的成苗率在60%～75%之間，而秋水仙素的成苗率僅在0%～59%之間，當處理濃度為0.2%，處理時間≥1 h時，成苗率為0.00%，可見秋水仙素對橡膠草的毒害作用要大于氨磺靈，這與孔素萍等[22]對大蒜多倍體誘導的研究結果大致相似，其原因可能因為秋水仙素與植物微管蛋白的親和性要比氨磺靈低，秋水仙素的誘變濃度一般要高于氨磺靈誘變濃度，且秋水仙素毒性要高于氨磺靈。誘變率和嵌合體率是判斷誘變劑誘變效果的重要指標。Sakhanokho等[23]誘導觀賞姜花多倍體結果顯示，氨磺樂靈誘變的效果（最高誘變率15%）優于秋水仙素（最高誘變率13%）。

閻志紅等[24]在西瓜四倍體誘導時，氨磺靈的四倍體誘導率高于秋水仙素，分別達33.3%和13.3%；孔素萍等[22]對大蒜多倍體誘導的研究結果顯示，氨磺靈的誘變率(20.25%)要高與秋水仙素(12.25%)，其嵌合體率(2.45%)要低于秋水仙素(3.10%)；而儲麗紅等[17]在安祖花多倍體誘導研究結果顯示，秋水仙素的四倍體誘導率高于氨磺靈，分別為45.10%和42.22%。可見，2 種誘變劑對不同植物的誘變效果存在差異。本研究中，氨磺靈的最高誘變率在14.08%，嵌合體率為27.27%；而秋水仙素的最高誘變率為5.56%，嵌合體率為75.00%，這與Luo 等[13]獲得的秋水仙素誘導四倍體橡膠草的最高誘變率(4.92%)一致。綜上所述，相對于秋水仙素，氨磺靈因具有高成苗率、高變異率和低嵌合體，而更適用于橡膠草多倍體誘變。其中，氨磺靈處理0.04 mmol/L處理30 min的誘變率最高，為14.08%，是橡膠草四倍體誘變的最佳處理條件。

3.2 倍性的鑒定

倍性鑒定是倍性育種的重要環節，簡單、快速、有效的鑒定倍性能大大減少工作量，實現早期篩選與應用，加快育種進程。染色體計數法是鑒定倍性最直觀、最可靠的方法之一，但制片難度較大，工作量大，而且嵌合體植株很難檢出，故不宜用來進行大批量的植株倍性快速鑒定[28]，由于橡膠草幼苗根尖細小，取材困難，用染色體計數法確定植株倍性就更難實施。流式細胞儀分析法根據測定細胞的DNA 含量比較染色體倍性，是近幾年發展起來的較為快捷、準確鑒定多倍體植株的方法，已在許多植物倍性鑒定中成功應用[29]，但由于不同植物的細胞結構不同及次級代謝產物的特殊性和復雜性，流式細胞儀鑒定植株倍性的適用性也不同[30]。本研究顯示，利用流式細胞儀可在植株幼苗階段可快速鑒定出多倍體、嵌合體，且流式細胞儀鑒定結果與傳統的染色體數觀察鑒定結果一致，證明該方法用于橡膠草植株倍性分析是有效的。此外，學者們在許多植物多倍體誘導研究中表明，四倍體植株常表現為根、莖、葉、花、果實等器官明顯增大，葉下表皮氣孔增大、密度減少等特點[29-30]。本研究顯示，橡膠草四倍體植株，較野生型二倍體植株，葉片顯著增厚(P<0.01)，花苞和種子顯著增大(P<0.01)，葉下表皮氣孔顯著增大、密度顯著減少(P<0.01)。這與Luo等[13]獲得的四倍體橡膠草形態變化一致，進一步說明這些形態特征可作為橡膠草多倍體初步快速鑒定和育種的有效方法。

4 結論

氨磺靈和秋水仙素2種誘變劑均能誘導出四倍體橡膠草。氨磺靈誘變效果和成苗率均高于秋水仙素，更適合用于橡膠草多倍體誘變，氨磺靈0.04 mmol/L處理30 min 的誘變率最高，為14.08%，是橡膠草四倍體誘變的最佳處理條件。利用流式細胞儀可在植株幼苗階段快速鑒定出多倍體、嵌合體，說明該方法可用于橡膠草快速倍性鑒定。對比形態特征顯示，橡膠草四倍體植株葉片增厚，花苞和種子增大，葉下表皮氣孔增大、密度顯著減少，與二倍體植株差異顯著，可作為多倍體初步篩選標準。本研究初步探明了2種誘變劑對橡膠草染色體加倍的誘導效果，為今后橡膠草多倍體育種提供理論依據和技術支持。