基于高通量測序的土壤細菌組成、豐度及多樣性分析

范 娜，彭之東，白文斌

（山西農業大學高粱研究所，高粱遺傳與種質創新山西省重點實驗室，山西晉中 030600）

0 引言

土壤鹽漬化影響農業生產和生態環境，已成為制約農業生產的一個主要因素[1]。全球大約20%的耕地為鹽堿地，還有一半的灌溉地正在演化為鹽漬地[2]，且呈逐年增長的趨勢。鹽堿地會影響土壤中微生物群落組成、數量及其分布。鹽脅迫降低土壤微生物的活性、微生物碳、氮量，從而導致有機質被微生物分解的能力下降，土壤質量降低必然導致作物出苗、生長及對營養物質的吸收和轉運，營養生長和生殖生長受抑制，產量減少甚至絕收。

利用耐鹽植物是改良鹽堿地的有效方式之一。植物的耐鹽性因種類、品種不同而耐鹽性有所區別，培育并篩選出耐鹽品種、挖掘作物的耐鹽特性應用于鹽堿地農業生產，可以緩解鹽漬化對農業生產的影響[3]。高粱是全球五大作物之一，抗逆性強，是鹽堿農田生長的先鋒作物、相對高產作物[4]。

山西省太原市清徐縣孟封村自然地理條件特殊，鹽漬化問題困擾當地農業生產。本研究選用10份不同的高粱親本材料在鹽堿地進行大田鑒選試驗，同時采集清徐縣鹽堿地土壤樣品，采用Illumina Miseq高通量測序方法相結合研究鹽堿地土壤微生物群落結構變化，旨在為高粱耐鹽材料的篩選及耐鹽性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗地基本情況 試驗于2017年5月—2019年10月在山西省太原市清徐縣孟封村進行。清徐縣屬暖溫帶大陸性氣候，年平均日照為2577.5 h，年平均氣溫為9.6～10.2℃，年均降水量為462 mm。土壤基礎理化性狀：pH 7.89、EC值1214.10 mS/cm、有機質10.04 g/kg、全氮0.07 g/kg、速效磷8.60 mg/kg、速效鉀172.13 mg/kg。

1.1.2 試驗材料 本實驗室前期通過室內試驗和大田試驗從400 份典型材料里篩選出10 份材料，分別為622-2、1012、1090、473、342、68、1187、67、135、366。

1.2 樣品采集與分析

1.2.1 土壤理化性狀的測定 土壤有機質測定采用重鉻酸鉀容量法，土壤全氮采用半微量凱氏定氮法，土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提、鉬銻抗顯色分光光度法，土壤速效鉀采用醋酸銨提取火焰光度法測定[4]。

1.2.2 樣品采集 土樣取樣深度為0～10 cm，每處取5個土樣，4℃下運輸至實驗室，用于測定其相關理化性質，部分樣品經冷凍干燥后保存在-80℃超低溫冰箱中用于DNA 提取和后續分子生物學試驗，充分混合用于DNA提取和高通量測序[5]。

1.3 高通量測序方法

采用高通量測序平臺軟件對數據處理、進行OTU聚類分析、3Alpha 多樣性分析、物種分類分析和多維度分析：基于OTU聚類分析和物種分類的共有分析。

1.4 種子生長指標

第3天統計發芽勢，第6天統計發芽率和相對鹽害率，計算公式如(1)～(4)所示。

1.5 數據分析

首先對原始數據進行質量過濾和雙端序列的連接，應用軟件cutadapt和Usearch對連接上的序列進行過濾和去除嵌合體。然后對得到的優質序列基于97%的相似水平上進行OTU 聚類，并利用Usearch。數據庫進行物種注釋[6-8]。

2 結果與分析

2.1 材料耐鹽測定

2.1.1 種子萌發生長情況 發芽率反映種子發芽的多少。從表1 可以看出：10 份高粱親本材料發芽率的數值范圍為44.1%～93.4%，其中材料473、342、67 發芽指標較高，表現出比較好的生長趨勢；材料68、622-2 發芽指標較低。發芽率與材料耐鹽性呈正相關。

表1 鹽堿對高粱萌發的影響

2.1.2 鹽脅迫對高粱苗期生長的影響 由表2 可以看出，473、342 生長速率較快，表現出較強的耐鹽性；材料68、622-2 生長指標數值較低。耐鹽材料鹽害系數低于鹽敏材料。

表2 鹽脅迫對高粱苗期生長速率的影響

2.2 樣品測序

采用Usearch 軟件去除預處理后序列中非擴增區域序列，對測序錯誤進行校正，調用uchime 進行鑒定嵌合體，將去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行blastn 比對，低于閾值的比對結果認為是靶區域外序列，并剔除掉該部分序列[9]。測序數據處理結果見表3。

表3 樣品測序數據處理結果

2.3 鹽堿地土壤細菌組成及豐度

OTU (Operational Taxonomic Units)指的是在系統發生學或群體遺傳學研究當中，為了便于分析，人為的給每個分類單元設置的同一標志。通常在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。在OTU聚類結果的基礎上，獲取OTU聚類中的代表性序列[11]。

由圖1 可知，10 個材料共有OTU 數為38 個，QTU總數為2109 個，其中樣品342 特有的OTU 數為293個，樣品67 特有的OTU 數為133 個，樣品322 特有的OTU 數為240 個，樣品68 特有的OTU 數為133 個，樣品135特有的OTU數為160個，樣品1060特有的OTU數為262 個，樣品1187 特有的OTU 數為241 個，樣品366 特有的OTU 數為255 個，樣品473 特有的OTU 數為137 個，樣品1012 特有的OTU 數為255 個。耐鹽材料OTU數量較多，表明土壤中微生物的群體數量與作物生長速率呈正相關。

圖1 基于OTU豐度的樣本聚類圖

2.4 多樣性指數分析

豐富度指數（Chao1 指數）高低代表群落或生境中物種數目和復雜度[12]。優勢度指數（Simpson 指數）表示一個群落或生境中優勢種的地位和作用，值越高說明群落內物種數量分布越不均勻，優勢種的地位越突出；多樣性指數（Shannon 指數）與群落多樣性指數成反比[13]。

土壤細菌的數量大，個體小，代謝強繁殖快，是土壤微生物的主要組成部分，占土壤微生物總數的70%～90%，它能分解土壤中各種有機質，由表4 可知，樣品342、473 的Chao1、ACE 和Shannon 指 數 均 最 高，Simpson指數最小，該材料的物種多樣性最高；相反鹽敏材料68、622 的Chao1、ACE 和Shan?non 指數均最低，Simpson指數最大，多樣性最低。耐鹽材料土壤中細菌種類數量多，土壤微生物的群體數量，微生物數量的增加及其生長速率的增大可有效地促進土壤酶的活性，為微生物的生長提供了較多更易利用的碳源、氮源等營養物質。

表4 Alpha多樣性指數統計

2.5 主成分分析

采用PCA 主成分分析，結果表明：主成分1(PCA1)、主成分2(PCA2)和主成分3(PCA3)樣品差異性貢獻率分別達到42.0%、25.0%和19.0%，三者合計達到86.0%，是差異的主要來源。由圖2 可知，1090 和1187 位于PC1 負值區、PC2 和PC3 的正值；1012 位于PC1 的負值區域，PC2 的正值區域及PC3 的正負兩側。622位于PC1的負值區域，PC2的正值區域及PC3的負區域，其余的位于PC1、PC2 的負值區域，PC3 的正值區域。說明樣品間的主成分變異顯著。

圖2 主成分分析

3 結論與討論

土壤微生物群落在物質循環、腐殖質分解、化學元素轉化和土壤質地改良等方面起著重要作用，其豐富度和多樣性是維持作物生長、發育的前提條件。鹽脅迫影響土壤微生物群落組成、數量及其分布，使微生物對土壤養分的分解作用下降[20]。

本實驗采用高通量測序技術對其細菌群落組成進行初步分析。在97%的相似度水平上，10個材料共有OTU 數為38 個，其中樣品342 特有的OTU 數最多為293 個，樣品,68特有的OTU 數最少為133 個。其中變形菌門為第一優勢菌群。這與李新等對內蒙古河套灌區不同鹽堿程度的土壤細菌研究結果一致、本研究中10個樣品共同的優勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬，說明其分布廣泛。此類菌屬具有耐鹽特性，群落中各物種具有越大的均勻度則群落具有越大的多樣性。