廣東黃心樹種質表型與遺傳多樣性分析

丁釋豐 高筱鈺 吳林源 黃稚清 秦新生 馮志堅

摘要：【目的】研究廣東地區黃心樹（Machilus gamblei）種質資源表型與遺傳多樣性，為黃心樹種質資源的保護、利用及新品種選育提供基礎數據。【方法】選擇廣東地區具有代表性的黃心樹種群，從廣州王子山森林公園、從化石門森林公園、惠州南昆山風景區等5個樣地取樣，測定黃心樹表型性狀指標與RAPD分子標記分析DNA片段多態性，探究黃心樹種質資源表型與遺傳多樣性參數在群體間、群體內的分布與特征。【結果】測定的黃心樹15個表型性狀指標中，有12個性狀指標的變異系數（CV）低于其平均值，11個性狀指標的遺傳多樣性指數（H'）高于其平均值，表明其表型性狀變異程度小，但變異類型豐富。高引物解析強度（Rp）引物OPAA-16、OPBH-10和OPB-17可有效評估黃心樹樣本間的遺傳多樣性。基于表型性狀對30份黃心樹樣本進行聚類分析，以遺傳距離10為閾值，廣州王子山森林公園、從化石門森林公園與汕頭南澳島旅游區的樣本的表征親緣關系較接近。基于RAPD分子標記對30份黃心樹樣本進行聚類分析，在遺傳距離為15時，可將所有樣本分為5個類群，惠州南昆山風景區、從化石門森林公園與廣州王子山森林公園的樣本遺傳距離較近，汕頭市南澳島旅游區與深圳馬巒山郊野公園的樣本也表現出相似的遺傳背景。對比廣東地區黃心樹表型性狀與RAPD分子標記的聚類分析，發現二者類群中樣本情況一致性較差。【結論】廣東地區黃心樹種質的表型與遺傳在種群間和種群內部變異都較為豐富，其中惠州南昆山風景區黃心樹種群的表型與遺傳多樣性最為豐富，樹種遺傳改良、資源開發利用等相關工作可于此處開展。

關鍵詞： 黃心樹;種質資源;表型多樣性;遺傳多樣性;廣東

中圖分類號： S792.24? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1291-09

Abstract：【Objective】To study the phenotype and genetic diversity of Machilus gamblei King ex Hook. f. germplasm in Guangdong and provide the basic data for conservation， effective utilization of M. gamblei gemplasm and the breeding of new varieties. 【Method】Five typical populations of M. gamblei in Guangdongwere selected， such as Guangzhou Wangzishan Forest Park， Conghua Shimen National Forest Park， Huizhou Nankunshan Resort and so on. Phenotypic traits were determined and RAPD markerswere used in this study to analyze DNA fragment diversity， to explore the distribution and characteristics of phenotypicand genetic diversity between the populations and inside the populations. 【Result】Among the 15 phenotypic traits of M. gamblei， the coefficient variation（CV） of 12 phenotypic traits were lower than its average; and the genetic diversity index（H'） of 11 traits were higher than the average. The result showed that M. gamblei variation degree of phenotypic traits was low， but the variation types were abundant. The high resolving power（Rp） primers， OPAA-16， OPBH-10 and OPB-17， could effectively evaluate the genetic diversity among different samples of M. gambleiin Guangdong. Based on phenotypic traits， 30 samples of M. gamblei were clustered when genetic distance was 10， and the characterization relationship of samples which from Guangzhou Wangzishan Forest Park， Conghua Shimen Forest Park and Shantou Nanao Island Resorts was close. At the genetic distance of 15， based on the RAPD markers， 30 samples could be divided into 5 groups， samples of Huizhou Nankunshan Resorts， Shimen Forest Park and Wangzishan Forest Park had close genetic distance， samples of Nanao Island Resorts and Shenzhen Maluanshan Country Park showed similar genetic background. By comparing the cluster of phenotypic traits and RAPD markers， poor consistency of samples in the two groups was found. 【Conclusion】The phenotypic traits and genetic diversity of M. gamblei in Guangdong has rich variation between the populations and inside the populations. Samples from Huizhou Nankunshan Resort show the richest variation in both phenotypic traits and genetic diversity， which would be helpful for germplasm resources species improvement， effective utilization and other related researches.

Key words： Machilus gamblei King ex Hook. f.; germplasm resource; phenotypic diversity; genetic diversity; Guangdong

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31870699）; Forestry Science and Technology Innovation Project of Guangdong（2014KJCX005-02，2017KJCX024）

0 引言

【研究意義】種質資源的遺傳多樣性是改良植物遺傳特性及培育新品種的重要基礎。黃心樹（Machilus gamblei King ex Hook. f.）系樟科（Lauraceae）潤楠屬（Machilus）常綠喬木，分布于我國華南和西南地區，在印度、尼泊爾及越南北部也有分布。黃心樹樹姿優美，花芽和新葉多彩艷麗，枝葉濃密青翠呈層狀伸展，材質優良且適應性強，在園林、建筑、醫學和香料等領域具有重要的生態和經濟價值，是開發前景較為廣闊的樹種（李陽等，2014;Chetia et al.，2017）。近年來，人類的過度砍伐與開發，黃心樹的生境不斷遭受破壞，加之植物大小年花果情況差異大、自身結實能力較低及自然更新能力不高等自身原因，黃心樹等潤楠屬植物生存境況令人堪憂（黃秋生等，2014）。廣東地區是黃心樹的主要產地之一，對該區域內黃心樹種質資源表型與遺傳多樣性進行研究，有利于黃心樹種質資源鑒定，為種質資源保存提供遺傳背景和實驗依據，對黃心樹種質資源進一步開發和地方特色品種選育工作有著重要的指導意義。【前人研究進展】作為飼養琥珀蠶（Antheraea assama Ww.）的經濟性作物（Chetia et al.，2017），國外對于黃心樹的相關研究開展較早，但大多集中于種植栽培方面。Das等（2010）、Chattopadhyay等（2014）、Boruah（2020）針對黃心樹炭疽病、灰枯病等病蟲害的發病原理進行了相應的研究。Devi等（2014）通過元素示蹤技術證實了黃心樹對于PM2.5及重金屬等有害物質有吸收和富集作用，能夠有效凈化環境。Gogoi等（2009）對4個黃心樹同源四倍體及其二倍體親本的質量性狀和數量性狀進行研究，證實了四倍體性狀更具穩定性，并提出有必要結合分子技術分析黃心樹的不同形態性狀。Rahman等（2012）應用RAPD分子標記對印度Assam Goalpara地區的黃心樹種質資源遺傳多樣性進行了研究，結果表明其遺傳多樣性較為豐富。Kumar（2016）針對黃心樹表型特征的研究，推測其表型特征的多樣性可能主要受氣候條件的影響。【本研究切入點】目前，國內對于黃心樹的研究較少且局限于栽培、用途及生態效益等方面（楊澤雄等，2016;馮力等，2020），在種質的收集、識別以及評估的相關研究還處于空白狀態。【擬解決的關鍵問題】以廣東地區黃心樹種群為試驗材料，通過測定其表型與遺傳多樣性分析遺傳結構的差異，探究黃心樹遺傳多樣性參數在群體間及群體內的分布與特征，為樹種遺傳改良、種質資源保護及資源深度開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

在實地調查及2年物候觀測的基礎上，于2018年9月—2019年3月從廣東省廣州王子山森林公園、從化石門森林公園、惠州南昆山風景區、深圳馬巒山郊野公園及汕頭南澳島旅游區黃心樹種群內進行取樣，選擇生長發育正常、無嚴重缺陷和無明顯病蟲害的植株（表1）。為保證取樣的均勻性，樣株間水平距離50 m以上，海拔相差5 m以上，隨機摘取樣株樹冠中部當年生枝5～10個和頂端輪生葉10～15片，用于表型性狀測定;于次年展葉期（2—3月），于同一樣株擇取健康幼葉若干，用密封袋貯藏，加入變色硅膠干燥，置于4 ℃低溫冷藏，用于種質遺傳多樣性分析。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 表型多樣性測定 選取黃心樹葉部表型性狀作為探討其親緣關系的性狀子集，共選擇15個表型性狀特征進行分析（表2）。黃心樹表型性狀可分為質量性狀和數量性狀，為準確、客觀地用數碼差別來反映質量性狀間的差異程度，同一質量性狀有多種狀態者采用有序多態編碼，同一特征各狀態間差別基本一致者，采用順序序列間隔相等的編碼數值;數量形狀為可直接測量的量，經掃描儀掃描后，應用Digimizer application 4.6.0測定。

1. 2. 2 遺傳多樣性測定 （1）DNA提取。選用上海生工生物有限公司Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒進行樣本DNA提取，試驗操作參考說明書進行。黃心樹葉片組織存在高濃度的酚類物質，為去除植物組織中的多酚與多糖，按照操作說明書加入三氯甲烷之后，每管用等體積酚·三氯甲烷（pH 8.0）反復混勻，于12000 r/min離心5 min，取上層清液，反復抽提3次，再按照說明書進行下一步操作。（2）RAPD引物篩選。隨機選取5個黃心樹樣本對Operon公司OPA、OPB、OPC、OPO、OPAA及OPBH組別的60個10堿基RAPD隨機引物進行篩選（Rahman et al.，2012），引物由上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。（3）PCR反應體系與擴增程序。PCR反應過程中退火溫度和退火時間對于擴增結果的影響較大（焦鋒和樓程富，2000），為使試驗結果更準確，在正式試驗前設置不同的退火溫度和退火時間，進行預實驗，以確定最佳擴增條件。通過相關預試驗，最終決定PCR擴增反應在20 μL體系中進行（10 μL 2×Taq Plus Master Mix，1.60 μL引物，1 μL樣本DNA，7.4 μL ddH2O）。PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，進行35個循環，72 ℃延伸6 min。（4）電泳條件：采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，電壓70 V，電泳時間150 min。

1. 3 統計分析

1. 3. 1 表型多樣性數據分析 表型指標數據用IBM SPSS Statistics 22.0進行處理，將對原始數據矩陣進行Z分數標準化處理，并用標準化后的矩陣求變異系數（Coefficient of variation，CV），利用Shannon-Weaver遺傳多樣性指數（Genetic diversity index，H'）來衡量性狀遺傳多樣性大小（劉志齋等，2008;李華鋒等，2016）。

1. 3. 2 遺傳多樣性數據分析 綜合每條引物電泳的條帶信息（Bands information，iB），計算每條引物的條帶多態率（Percentage of polymorphic bands，PPB）與引物解析強度（Resolving power，Rp）。依據PCR擴增產物電泳后的條帶，采取1/2賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現DNA片段的記為1，未出現DNA片段的記為2;所得數據運行IBM SPSS Statistics 22.0進行分析，采用Jaccard法進行聚類分析，計算遺傳相似系數（Genetic similarity coefficient，GS）及遺傳距離。

2 結果與分析

2. 1 黃心樹種質表型多樣性分析

2. 1. 1 變異系數與遺傳多樣性指數分析 廣東地區黃心樹種質資源15個表型性狀的CV值為28.33%，其中幼枝毛被情況和冬芽芽鱗毛被情況的CV值最小，均為0%;葉尖偏向的CV值最大，其次是幼枝皮孔數量和葉面積指數，分別為118.42%、93.04%和29.59%。表型性狀的H'為1.1764，其中葉片長度的H'最大，為1.6029;葉尖長度、葉長/葉尖、左葉基角和葉基角比（左/右）的H'也均超過1.5000;幼枝毛被情況和冬芽芽鱗毛被情況的H'最小，均為0（表3）。

2. 1. 2 基于表型性狀的聚類分析 將黃心樹15個表型性狀數據經標準化處理后，對30份樣本進行聚類分析。以遺傳距離15為閾值，樣本被分為3個類群，分別包含14、5和11份樣本。如圖1所示，以遺傳距離10為閾值，可將所有樣本分為5個類群，類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別包含9、5、5、4和7份樣本。類群具體特點：類群Ⅰ中以從化石門森林公園和汕頭南澳島旅游區的樣本為主;深圳馬巒山郊野公園樣本多集中于類群Ⅲ中;類群Ⅴ中以廣州王子山森林公園和汕頭南澳島旅游區的樣本為主。此外，所有類群中均有惠州南昆山風景區的樣本，而其他樣地的樣本分別只在3個類群中有所分布。

2. 2 引物擴增產物分析

2. 2. 1 引物篩選結果 有研究表明，當不同樣本間表型形態差異較大時，種類較少的引物就能夠評估不同個體之間的遺傳多樣性（Clegg et al.，2002）。選取WZS-1、SM-1、NKS-1、MLS-1和NAD-1等5個樣本對OPA、OPB、OPC、OPO和OPAA及OPBH組別的60個RAPD隨機引物進行篩選，根據擴增條帶的清晰度、穩定性及多態性共篩選出10條RAPD引物（表4）。

2. 2. 2 引物條帶分析 廣東地區黃心樹種質資源在表型性狀上表現出一定的差異性，通過RAPD分子標記揭示其種質遺傳物質的多態性水平也較高。用10條RAPD引物對30份樣本進行PCR擴增，共計擴增出51個條帶，大小為100～2500 bp，平均每條引物可擴增出5.1個條帶，PPB為50.00%～85.71%（表5）。其中，多態性條帶共擴增出34個，占總條帶數的66.67%，平均每條引物擴增出3.4個多態性條帶，平均多態性比率達64.81%。Rp是衡量引物品種辨別能力和引物效率的重要指標，本研究中使用的單一引物不能夠區分所有的樣本DNA的多樣性，但高Rp的有效引物（OPAA-16、OPBH-10和OPB-17）可用于評估不同樣本間的遺傳多樣性（圖2）。

2. 3 黃心樹種質遺傳多樣性分析

2. 3. 1 遺傳相似系數分析 基于RAPD分子標記的圖譜矩陣結果計算30份黃心樹樣本，結果顯示遺傳相似系數為0.36～0.96，平均值為0.75。遺傳相似系數矩陣熱圖（圖3）顯示了群體間NAD-6與MLS-3、NAD-5與NKS-3及WZS-5與NKS-1的遺傳相似系數最大，均為0.96，表明這些樣本的遺傳背景相似，親緣關系較近;NKS-5與MLS-4、MLS-6的GS值最小，分別為0.38和0.37，表明其親緣關系最遠。此外，矩陣熱圖還顯示惠州南昆山風景區的黃心樹樣本的遺傳相似系數平均值最低，僅0.69，表明在所有樣地中惠州南昆山風景區的黃心樹種群遺傳多樣性程度最高;廣州王子山森林公園的黃心樹樣本的遺傳相似系數平均值最高，其次為汕頭南澳島旅游區，群體遺傳相似系數平均值分別為0.86和0.84，表明其群體內遺傳多樣性程度較低。

2. 3. 2 基于RAPD分子標記的聚類分析 基于RAPD分子標記的PCR擴增結果，對廣東地區30份黃心樹樣本進行聚類分析（圖4）。在遺傳距離為20時，可將所有樣本分為3個類群，分別為包含12份樣本和16份樣本的2個主類群，以及包含2份樣本的次類群。在遺傳距離為15時，可將所有樣本分為5個類群，類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別包含4、8、10、6和2份樣本;類群具體特點：類群Ⅰ以惠州南昆山風景區、廣州王子山森林公園的樣本為主，類群Ⅱ主要包含從化石門森林公園、廣州王子山森林公園的樣本，類群Ⅲ的樣本以汕頭市南澳島旅游區、深圳馬巒山郊野公園為主。將上述結果與廣東地區黃心樹表型性狀聚類結果對比，發現二者類群中樣本情況不完全一致，推測其表型多樣性與遺傳多樣性發生機制不同。

3 討論

對廣東地區30份黃心樹種質樣本的15個表型性狀的CV和H'進行分析，結果表明30份樣本表型性狀CV與H'一致性較低。CV反映了性狀差異的離散程度，其大小反映的是性狀變異范圍大小（王海平等，2014）;H'是反映種質資源間多樣性的另一個重要指標，其大小反映了性狀多樣性的豐富程度（趙香娜等，2008），因此，CV和H'間不存在相關關系。植物種群的空間結構特征意味著植物必須適應不同的環境條件，并因生境的差異產生種群的生態分化，而植物營固生長的習性決定了植物在環境中的表型性狀特征具有很大的可塑性（胡啟鵬等，2008）。本研究發現，黃心樹15個表型性狀指標中，有12個性狀指標的CV低于其平均值，11個性狀指標的H'高于其平均值;證明廣東地區黃心樹表型性狀變異程度小，但變異類型豐富，這一特性有利于黃心樹的資源配置。

本研究使用10條RAPD引物有效評估了廣東地區黃心樹種質樣本的遺傳多樣性，其中高Rp的引物OPAA-16、OPBH-10和OPB-17可用于評估黃心樹不同樣本間的基因遺傳多樣性。基于RAPD分子標記所揭示廣東地區黃心樹種質遺傳多樣性程度較高，但相較于RAPD分子標記對浙江潤楠、黑殼楠、舟山新木姜子及香樟等其他樟科樹種種質遺傳多樣性的研究而言（宋愛云等，2003;Wang et al.，2005;張守鋒，2012;駱嘉言等，2017），廣東地區黃心樹種質的遺傳變異程度并不算高。基于RAPD分子標記的遺傳相似矩陣表明，惠州南昆山風景區黃心樹種群表型及遺傳多樣性最為豐富，可為種質資源的綜合利用、開發提供原材料，樹種遺傳改良、資源開發利用等相關工作可于此處開展。

聚類分析發現，廣東地區黃心樹樣本的表型與遺傳在群落間和群落內均存在一定的多樣性。植物表型性狀特征的體現是生境條件與遺傳物質共同作用的產物，研究發現生境條件類似的黃心樹種群在表型與遺傳多樣性上相似性程度較高。廣州王子山森林公園、從化石門森林公園與惠州南昆山風景區的黃心樹樣本在表型與遺傳上的變異較其他樣地的樣本都更為接近，這3個樣地間的地理距離較為接近，并有著相似的氣候條件，結合潤楠屬植物在我國的地理分布（胡曉敏等，2011;胡文強等，2017），推斷上述3個樣地的黃心樹種群親緣關系最為接近，之前或屬于同一種群，造成如今片狀分布的結果可能是由于人類活動導致的限制因子或生態障礙所致。同時也發現，深圳馬巒山郊野公園與汕頭南澳島旅游區的黃心樹樣本的親緣關系也較為接近。現有的研究成果已經肯定了不同生態小環境可導致不同群體遺傳結構的顯著差異（Taylor and Aarssen，1990;Gehring and Linhart，1992）。若同種植物的生活史相同，且生活史格局具有同一性，那么小生境差異形成的自然選擇作用將進一步引起種群間的歧化過程。汕頭南澳島旅游區和深圳馬巒山郊野公園均具有海、陸屬性動態而復雜的自然環境，面臨著空氣、土壤中的鹽分及臺風氣候等對植物造成的傷害（侯夢瑩等，2019），這些遺傳上的變異雖然不一定表現在表型性狀特征上，但一定程度上可推斷黃心樹生態適應的方向和途徑與其環境綜合作用中的主導因子密切相關。

此外，聚類分析發現同一樣地的黃心樹樣本并未形成單一類群，可能與其分布范圍廣、分布區內環境因素多樣有關。地理隔離導致基因流動的隔離是導致群體間遺傳分化的因子之一，但地理隔離在種群分化過程中的相對貢獻尚不明確（He et al.，2016;Zhang et al.，2016）。地理距離與群體間遺傳分化程度有所關聯，但造成特定的遺傳差異需結合各項生長因子（葉俊偉等，2017），因此不能完全以地理距離劃分物種的遺傳變異方向異同（楊曉霞等，2016）。

4 結論

基于黃心樹表型性狀測定與RAPD分子標記技術所揭示的廣東地區黃心樹種質在群落間和群落內的表型與遺傳多樣性程度較高。其中，惠州南昆山風景區黃心樹種群表型與遺傳多樣性最為豐富，可為種質資源的綜合利用、開發提供原材料，樹種遺傳改良、資源開發利用等相關工作可于此處開展。

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（責任編輯 鄧慧靈）