CsCAT3克隆與其在冷馴化誘導采后黃瓜耐冷性中的作用初探

王 斌 武春爽 何金明 王 光 曲姍姍 朱世江

(1韶關學院英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642)

黃瓜(Cucumis sativusL.)是我國主要栽培的設施蔬菜，果實是其最主要的商品器官[1]。黃瓜采收后，由于其組織鮮嫩，含水量高，常溫貯藏極易腐爛變質，導致商品性降低甚至喪失，造成嚴重的經濟損失[2]。因此，生產上通常采用低溫貯運保持采后黃瓜的商品性。但采后黃瓜對低溫敏感，貯藏溫度低于10℃時容易發生冷害[3]。產生冷害的黃瓜在貨架期極易被病原微生物感染，導致嚴重的次生病害，使得商品性降低[4]。因此，采取一定的措施誘導采后黃瓜耐冷性，對于減輕冷害并防止次生病害具有重要意義。

過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種重要的抗氧化防御酶，其功能主要是清除光呼吸、線粒體電子鏈傳遞以及β－脂肪酸氧化等過程中產生的過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)，以避免活性氧(reactive oxygen species，ROS)對植物造成氧化損傷[5]。大多數植物基因組僅含有3 個CAT基因，根據在不同組織中的表達差異，CAT基因被分為3 個類型[6]。Ⅰ類CAT基因在光合組織中高表達，Ⅱ類在維管組織中高表達，而Ⅲ類在生殖器官中高表達[7]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtCAT1、AtCAT2 和AtCAT3 分別屬于Ⅲ類、Ⅰ類和Ⅱ類CAT基因[8]。研究表明，CAT的表達與植物抗逆性密切相關。擬南芥AtCAT2 可被低溫和干旱脅迫顯著誘導，而AtCAT3 可被氧化脅迫所誘導[9]。干旱脅迫能顯著影響斑茅(Erianthus arundinaceus)EaCAT－1b和甘蔗(Saccharum officinarumL.)SoCAT－1c的表達[10]。番茄(Solanum lycopersicum)中過表達大腸桿菌katE基因，能明顯增強葉片對光氧化損傷脅迫的耐受性[11]。擬南芥中超表達西蘭花BoCAT，顯著提高了耐熱性[12]。

鹽脅迫和干旱脅迫抑制黃瓜幼苗CsCAT1 和CsCAT2 的表達，但可以誘導CsCAT3 表達，而低溫脅迫對黃瓜幼苗CsCAT1、CsCAT2、CsCAT3 表達的影響不明顯[7]。在大腸桿菌中過表達黃瓜CsCAT3，增強了宿主細胞對熱脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[13]。本團隊前期研究發現，外源茉莉酸甲酯和一氧化氮處理采后黃瓜，提高了CsCAT3 表達以及CAT 活性，從而增強冷藏黃瓜的抗氧化能力和耐冷性[14]。同樣，冷馴化處理也能顯著誘導采后黃瓜耐冷性，減少冷害發生[15－16]，但冷馴化誘導的耐冷性是否與CsCAT3的表達有關，值得進一步研究。

本研究通過克隆CsCAT3 基因，研究冷馴化對CsCAT3 基因表達和CAT 活性的影響，旨在探明CsCAT3 表達在冷馴化誘導耐冷性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

本研究選用黃瓜品種為翠夏(由廣東金穗現代種業有限公司培育)，在園藝成熟度時采收，并及時運回廣東省果蔬保鮮重點實驗室，室溫條件下，3 h 內運回實驗室。挑選果形和大小基本一致、無機械傷、無病蟲害的供試黃瓜，設置對照組和處理組。對照組直接貯藏在5℃冷庫，處理組先于10℃貯藏3 d，再貯藏于5℃冷庫，每組60 根黃瓜，處理設置3 個重復，即每個重復20 根黃瓜。依次在貯藏當天(0 d)和貯藏期間(3、6、9 和12 d)采樣，每個處理取3 根黃瓜，削去果皮，液氮速凍后保存于－80℃冰箱。所取樣品用于酶活性測定、總RNA 和總蛋白提取等試驗。

1.2 試劑與菌株

植物總RNA 提取試劑盒(RNApre Pure Plant Plus Kit)購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒(iScript cDNA Synthesis Kit)、3－[(3－膽酰胺丙基)二甲基銨基] －1－丙磺酸鹽(3-[(3-(holamidopropyl)dimethy lammonio]-1-propane sulfonate，CHAPS) 和30%聚丙烯凝膠酰胺由美國Bio-Rad 公司生產；普通Taq 酶和高保真DNA 聚合酶、PCR 產物回收試劑盒、質粒提取試劑盒、二硫蘇糖醇(1，4-dithio-DL-threitol，DTT)和氨芐霉素均購自上海生工生物工程有限公司；大腸桿菌感受態DH5α 購自上海唯地生物有限公司；克隆載體pMD18-T 購自日本TaKaRa 公司。

丙酮、乙酸、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鈦和30%過氧化氫，產自廣州化學試劑廠；考馬斯亮蘭R250，產自上海碧云天生物技術有限公司；牛血清蛋白，產自美國Sigma 公司；β－巰基乙醇，購自廣州華奇盛生物科技有限公司；兩性電解質Ampholine、Tris－飽和酚、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，購自健陽生物科技有限公司；Triton-X100 和尿素，購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA 提取和反轉錄 使用RNA 提取試劑盒提取黃瓜果皮總RNA，利用反轉錄試劑盒合成單鏈cDNA。總RNA 提取和反轉錄的步驟與具體方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 黃瓜CsCAT3 克隆 將擬南芥AtCAT3(NM_101913.4)序列提交到黃瓜基因組數據庫(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)進行BLAST 比對，得到黃瓜CsCAT家族基因的核苷酸序列，將與AtCAT3 同源性最高的基因命名為CsCAT3。

以cDNA 為模板，使用特異引物(正向:5′-ATGGA TCCTTACAAGTACCGTCCA-3′；反向:5′-TTAGATGTTT GGCCTCACATTCA-3′)擴增CsCAT3 全長序列，引物由上海生工生物工程有限公司(廣州分公司)合成。用高保真DNA 聚合酶進行PCR 擴增，PCR 反應條件和步驟如下:95℃預變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，35 個循環；延伸10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR 產物。回收產物在3′端加A 后連接pMD18-T 載體，使用熱激法轉化大腸桿菌DH5α 感受態。轉化方法如下:將10 μL連接反應液加至100 μL 的DH5α 感受態中，冰上靜置30 min，42℃熱激90 s，立即冰浴5 min。將轉化重組質粒的DH5α 大腸桿菌預培養1 h 后，待抗性基因充分表達，取適量預培養的菌液涂板在含氨芐霉素的固體LB 培養基上，37℃過夜培養。挑取陽性克隆的DH5α 菌落送至上海生工生物工程有限公司(廣州分公司)進行測序驗證。

1.3.3 生物信息學分析 通過Cell-PLoc 2.0(http:/ /www.csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/) 和pLoc_Deep-mPlant(http:/ /www. jci-bioinfo. cn/pLoc _ DeepmPlant/)在線工具預測CsCAT3 蛋白的亞細胞定位；使用NCBI 數據庫的CDD(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)預測其保守結構域[17]。使用 ExPASy ProtScale ( https:/ /web. expasy. org/protscale/)分析其理化性質。用SignalP－5.0 (http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白質信號肽分析。采用ExPASy TMpred 網站(https:/ /embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)對其跨膜結構域進行預測，得分超過500 即被認為存在顯著意義。利用SOPMA (https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page ＝npsa_sopma.html)預測CsCAT3 蛋白的二級結構。利用 SWISS-MODEL ( https:/ /swissmodel.expasy.org/)對其三級結構進行預測。最后，利用DNAMAN 對CsCAT3 蛋白與其同源蛋白進行氨基酸序列多重比對，利用在線工具WebLogo(http:/ /weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對CsCAT3 及同源蛋白的氨基酸保守性進行分析，并以MEGA 7.0 中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統發育進化樹。

1.3.4 半定量RT-PCR 分析 以cDNA 為模板，CsActin(登錄號:AB010922.1)作為內參基因，分別擴增CsCAT3 和CsActin基因。擴增CsActin的正向引物序列為5′-AGGCCGTTCTGTCCCTCTAC-3′，反向引物序列為5′-CAGTAAGGTCACGACCAGCA-3′。擴增CsCAT3的引物信息、PCR 反應條件和步驟同1.3.2。

1.3.5 Western blot 分析 使用Tris－酚抽提法提取總蛋白[11]，具體方法如下:稱取5 g 研磨成粉狀的果皮，加入20 mL 蛋白提取液(內含0.1 mmol·L－1Tris-HCL、1%β－巰基乙醇、0.1%Triton-X100、1 mmol·L－1PMSF、10%PVP，pH 值9.0)，4℃渦旋混勻，12 000 r·min－1離心20 min，收集上清液。上清液中加入等體積的Tris－飽和酚(pH 值8.0)，充分混勻，4℃、12 000 r·min－1離心20 min。取酚層，加入5 倍體積的0.1 mol·L－1乙酸甲醇溶液，－20℃沉淀2 h。4℃、12 000 r·min－1離心20 min，沉淀用預冷的甲醇和丙酮分別洗滌1 次。在沉淀中加入適量裂解液[內含9 mol·L－1尿素，1%DTT，2%CHAPS、1%兩性電解質(pH 值3.5～9.0)]，室溫裂解1 h。采用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度[18]，提取的黃瓜果皮總蛋白濃度在1.5～6.0 mg·mL－1之間。

各取樣點使用相同用量(5 μg)的總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)垂直電泳。電泳完成后，依次進行轉膜、洗膜、封閉抗體、顯色、成像等操作。所用CsCAT3 單克隆抗體由廣東省果蔬保鮮重點實驗室制備[19]。

1.3.6 CAT 活性和H2O2含量測定 稱取1 g 研磨充分的樣品，加入5 mL 0.2 mol·L－1磷酸緩沖溶液(pH值7.8)，冰上渦旋混勻。在4℃、12 000 r·min－1條件下離心15 min，收集上清，用于測定CAT 活性。

稱取1 g 樣品，加入5 mL 冷丙酮充分研磨。4℃下12 000 r·min－1離心15 min，收集上清，用于測定H2O2含量。

CAT 活性和H2O2含量的測定按照Wang 等[15]方法進行。吸光度值每降低0.01 表示為1 個CAT 活性單位(U)。

1.4 數據分析

采用Excel 2016 軟件整理和分析數據，并制作圖表。使用SPSS 15 軟件檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 黃瓜CsCAT3 的克隆

以黃瓜果皮cDNA 為模板，使用特異引物進行PCR 擴增。從PCR 產物電泳圖中看出，擴增出了一條與預期結果相符的目的條帶(1 479 bp)(圖1-A)。經測序鑒定，克隆到的序列與基因組[(Chinese Long)genome v3]中公布的CsCAT3 全長序列完全一致，表明成功克隆到了CsCAT3 全長。CsCAT3 定位在6 號染色體，含有4 個內含子和5 個外顯子。其中，第5 個外顯子最長，長1 149 bp(圖1-B)。

圖1 黃瓜CsCAT3 全長PCR 電泳圖(A)及其在染色體上的定位(B)Fig.1 Electrophoresis image of full length of cucumber CsCAT3 gene (A) and it’s location in chromosome (B)

2.2 黃瓜CsCAT3 蛋白基本特性

使用ProtParam 工具分析了CsCAT3 蛋白的基本特性，CsCAT3 蛋白的理論分子量和等電點分別為57.01 kDa 和6.84。由492 個氨基酸殘基組成，氨基酸序列中的天冬氨酸和絲氨酸所占比例最高，分別為7.9%和7.5%。帶負電荷和正電荷的殘基總數分別為60 和58，分子式為C2562H3869N721O727S19。不穩定系數為42.25，表明黃瓜CsCAT3 是一個不穩定蛋白。

ExPASy ProtScale 預測的CsCAT3 蛋白的親水性得分均值為－0.49(圖2-A)，脂肪族指數為－0.546，表明CsCAT3 是一種親水性蛋白質。CsCAT3 蛋白的跨膜結構域預測得分小于500，表明不存在跨膜結構域(圖2-B)，且沒有信號肽。

圖2 黃瓜CsCAT3 蛋白基本特性Fig.2 Basic characteristics of cucumber CsCAT3 protein

CsCAT3 蛋白的二級結構以無規則卷曲(紅色)為主，占總體結構的49.80%，其次為α 螺旋(藍色，27.24%)、β 折疊(綠色，6.30%)和β 片層(紫色，16.67%)(圖2-C)。以CsCAT3 氨基酸序列為模板建模，CsCAT3 蛋白的三級結構與短小芽孢桿菌CAT(SMTL ID: 4qol.1)的三級結構相似性最高。SWISSMODEL 網站構建的CsCAT3 蛋白的三級結構如圖2-D所示。CsCAT3 蛋白的三級結構由4 個中心對稱的亞基構成，表明其可能通過形成中心對稱的四聚體結構行使功能。

使用Cell-PLoc 2.0 和pLoc_Deep-mPlant 在線工具預測CsCAT3 蛋白的亞細胞定位，兩個工具預測的結果均顯示，CsCAT3 蛋白定位在過氧化酶體中(圖2-E)。

2.3 不同物種CAT3 核苷酸序列同源性分析

對CsCAT3(CsaV3_6G031490)和其他4 種模式植物CAT3 基因的核苷酸序列進行BLAST 比對，發現CsCAT3 與其他CAT3 的相似性為69.29%～71.82%，CsCAT3 與番茄SlCAT3(XM_004238382.3)同源性最高，與水稻OsCAT3(XM_015787591.2)的同源性最低(表1)。不同植物的CAT3 基因同源性為69.29%～91.89%(表1)，表明物種間的CAT3 基因高度同源。

表1 不同物種CAT3 基因同源性比較Table 1 Homology comparison of CsCAT genes in different plant species

2.4 不同物種CAT3 蛋白同源性和保守性分析

5 種植物CAT3 蛋白均由492 個氨基酸殘基組成，且序列之間的相似性非常高。氨基酸序列中均含有CAT 蛋白保守域，由297 個氨基酸構成(圖3)。表明植物CAT3 蛋白高度同源，證實本試驗成功克隆到了黃瓜CsCAT3 基因。

氨基酸保守性分析中，氨基酸字母高度越高，保守性越好。由圖4 可知，5 種植物的CAT3 蛋白保守性很高，表明植物CAT3 氨基酸在進化過程中高度保守。

根據5 種植物的CAT3 氨基酸序列構建進化樹(圖5)。結果顯示，黃瓜CsCAT3(CsaV3_6G031490)與4 種模式植物CAT3 的進化距離都很近，與番茄SlCAT3(XP_004238430.1)的進化距離最近，其次由近到遠依次是煙草NtCAT3(NP_001312022.1)、擬南芥AtCAT3(NP _ 564120.1) 和 水 稻 OsCAT3 ( XP _015643077.1)。進化樹結果反映了物種間CAT3 蛋白的親緣關系，再次證明克隆到的基因是CsCAT3。

2.5 冷馴化處理對采后黃瓜CsCAT3 基因和蛋白表達的影響

為探究冷馴化誘導的耐冷性與黃瓜CsCAT3 表達的關系，檢測了CsCAT3 在轉錄和蛋白水平上的表達情況。由圖6 可知，對照組中，在冷藏期間CsCAT3 基因的表達逐漸降低，在貯藏12 d 時表達量下降到非常低的水平。而在冷馴化處理中，與貯藏0 d 相比，冷馴化處理在貯藏1 d 時上調了CsCAT3 基因表達。此后，盡管CsCAT3 表達也隨時間延長而降低，但表達量明顯高于對照，表明冷馴化處理誘導了黃瓜CsCAT3 基因的表達。

在蛋白表達水平，黃瓜CsCAT3 蛋白的表達趨勢與轉錄水平基本一致。對照組和冷馴化處理組中，CsCAT3 蛋白的表達在貯藏3 d 時輕微上調，隨后逐漸降低。但冷馴化處理組的表達量均明顯高于對照組(圖7)，從蛋白層面再次證實冷馴化處理誘導了CsCAT3 表達。

2.6 冷馴化處理對采后黃瓜CAT 活性和H2O2 含量的影響

由圖8－A 可知，對照組的CAT 活性總體呈下降趨勢，而冷馴化處理組的CAT 活性先增加后降低，在貯藏6 d 時活性最高。此外，冷馴化處理組的CAT 活性顯著高于對照組(除貯藏0 d)，表明冷馴化處理誘導了CAT 活性，這可能是CsCAT3 基因表達上調的結果。

由圖8－B 可知，對照組和冷馴化處理組的H2O2含量均先增加后降低，除0、3 d 外，處理組的H2O2含量均顯著低于對照組。表明冷馴化通過增強CAT 活性，提高了對H2O2的清除能力，減輕了由H2O2過量所導致的氧化脅迫。貯藏3 d 時，處理組H2O2含量顯著高于對照組，表明冷馴化在貯藏前期誘導了H2O2。H2O2是一種重要的信號分子，在誘導防御基因表達方面具有重要作用，推測H2O2在冷馴化誘導CAT3 表達過程中發揮了作用。

3 討論

圖3 黃瓜CsCAT3 蛋白與4 種模式植物CAT3 氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

CAT廣泛存在于植物體中，其功能涉及植物生長發育以及抗逆性等多個方面，包括提高光合能力[20]、增強抗逆性[21－22]、延緩衰老[23]、提高細胞全能性[24]、控制胞內氧平衡[25]等，最主要的功能是增強植物細胞的抗氧化性[26－27]。植物CAT 家族蛋白的分子量在55～69 kDa 之間，是由4 個亞基組成的四聚體(Tetramer)血紅蛋白，有保守的活化中心和鐵血紅蛋白結合位點[28]。本研究從黃瓜果皮中克隆到了CsCAT3 基因，其全長1 479 bp，編碼492 個氨基酸殘基。生物信息學分析結果顯示，黃瓜CsCAT3 蛋白沒有跨膜結構域和信號肽，是一個親水性不穩定蛋白，表明該蛋白是一種可溶性蛋白，不能分泌到胞外，與劉云芬[19]的研究結果一致。三級結構分析顯示，CsCAT3 蛋白由4 個亞基構成，且4 個亞基形成一個中心對稱的穩定四聚體，表明該蛋白是一個典型的CAT 蛋白。

研究表明，植物CAT 家族蛋白主要分布在過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質中，少數CAT 蛋白定位在線粒體內[8]。線粒體、葉綠體、質外體和過氧化物酶體中均可產生H2O2，其中由非生物脅迫導致的H2O2主要由過氧化物酶體產生，CAT 在清除H2O2中發揮重要作用[29]。借助亞細胞分離和原位活性染色技術，Mhamdi 等[30]發現過氧化物酶體中的CAT 活性最高，且其他細胞器中的CAT 可以轉移到過氧化物酶體。本研究結果表明，黃瓜CsCAT3 蛋白定位在過氧化物酶體中。定位在過氧化物酶體的CAT3 可在原位轉化成具有活性的CAT 酶，從而及時清除由各種脅迫引起的H2O2含量增加，這可能是植物應對非生物脅迫的一種重要防御機制。

圖4 黃瓜CsCAT3 蛋白與四種模式植物CAT3 氨基酸序列保守性比較Fig.4 Conservation comparison of amino acid sequence between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

與其他生物不同的是，植物一般生長在一個固定位置，不能自主移動。為了存活，植物在進化過程中要不斷進化，從而適應環境變化。抗氧化防御系統是植物應對環境變化的重要防御機制[31]，在進化過程中通常會保留。本研究結果顯示，黃瓜CsCAT3 蛋白與4種模式植物的CAT3 的同源性和保守性很高，進化關系很近，表明植物CAT3 在進化過程中高度保守。

圖5 黃瓜CsCAT3 蛋白與4 種模式植物CAT3的親緣關系Fig.5 Evolutionary relationship between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

冷害是限制低溫貯運技術在采后產業中廣泛應用的主要因素之一，通過一定的方式處理采后果蔬，可誘導其產生抗冷性，從而減輕冷害癥狀，減少采后損失[3]。研究表明，冷馴化是一種有效誘導采后黃瓜耐冷性的處理方式[4，15－16]。作為重要的抗氧化防御酶，CAT 在增強植物抗逆性中發揮重要作用[32]。在水稻中過表達大腸桿菌katE，提高了水稻CAT 活性和對鹽脅迫的耐受性[33]。擬南芥突變體cat2 的CAT 活性只有野生型的10%，而突變體cat1 和cat3 的CAT 活性比突變體cat2 更低[8]。本研究中，冷馴化上調了CsCAT3在轉錄和蛋白水平的表達，表明冷馴化處理誘導了采后黃瓜CsCAT3 表達，這可能是CAT 活性在冷馴化處理中較高的重要原因。而高活性的CAT 能及時清除H2O2，減輕由H2O2過量而導致的氧化脅迫。這些結果表明，冷馴化通過誘導CsCAT3 表達，提高了冷藏黃瓜的抗氧化能力，使得冷藏黃瓜耐冷性增強。

4 結論

CsCAT3 是典型的植物CAT 家族基因，且不同植物的CAT3 高度保守。冷馴化處理誘導了采后黃瓜CsCAT3 在轉錄和蛋白水平的表達，提高了CAT 活性，緩解了氧化脅迫，表明CsCAT3 在冷馴化誘導的耐冷性中具有重要作用。

圖6 冷馴化對冷藏黃瓜CsCAT3 基因表達的影響Fig.6 Effects of pre-storage cold acclimation on the expression of CsCAT3 gene in cold-stored cucumber

圖7 冷馴化對冷藏黃瓜CsCAT3 蛋白表達的影響Fig.7 Effects of pre-storage cold acclimation on the expression of CsCAT3 protein in cold-stored cucumber

圖8 冷馴化對冷藏黃瓜CAT 活性(A)和過氧化氫含量(B)的影響Fig.8 Effects of pre-storage cold acclimation on the CAT activities (A) and H2O2 contents (B) in cold-stored cucumber